苦瓜多糖的提取、結(jié)構(gòu)及生物活性研究進展

龔 斌，申明月，何陵玲，謝建華

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640）

苦瓜多糖的提取、結(jié)構(gòu)及生物活性研究進展

龔 斌1,2，申明月1,*，何陵玲1,2，謝建華1,*

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640）

苦瓜是一種藥食同源瓜果，已有上千年的食用歷史，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)苦瓜多糖是苦瓜中主要的生物活性物質(zhì)之一。苦瓜多糖是一種復(fù)合雜多糖，研究發(fā)現(xiàn)其具有許多生物活性。本文從苦瓜多糖的提取、分離純化、理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特性、生物活性等方面對其研究進展進行了較為系統(tǒng)的介紹與分析，并對苦瓜多糖的研究前景進行了展望。

苦瓜多糖；分離純化；理化性質(zhì)；結(jié)構(gòu)；生物活性

苦瓜又稱為涼瓜、錦荔枝、癩葡萄，是葫蘆科苦瓜屬植物果實，素有“藥用蔬菜”之稱，具有消暑降血、清熱解毒等功效[1]。苦瓜中含有許多重要的生物活性成分，如：苦瓜皂苷、生物堿、類奎寧蛋白、苦瓜多糖等[2-3]。近年來，對苦瓜的研究主要集中在苦瓜蛋白、苦瓜皂苷等方面[4]，不過隨著多糖領(lǐng)域研究的迅速發(fā)展，苦瓜多糖也逐漸進入國內(nèi)外各學(xué)者的視野，有研究表明：苦瓜多糖具有提高人體免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗氧化、降血糖血脂、抗腫瘤、抗突變等多種生理功效[5-7]。因此，無論在其藥用還是保健領(lǐng)域，對苦瓜多糖的研究都具有廣闊的市場前景。本文基于對苦瓜多糖各方面的研究成果，結(jié)合最新研究動態(tài)，就苦瓜多糖的提取、分離純化、理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特性、生物活性等方面的研究進展進行綜述，并對上述研究方法進行比較分析，探討目前存在的問題，以期為苦瓜多糖的深入研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 苦瓜多糖的提取、分離純化

1.1 苦瓜多糖的提取

提取苦瓜多糖前需對原料進行預(yù)處理，即洗凈苦瓜、去瓤、切片、脫水干燥、粉碎、過篩得苦瓜粉[7]。苦瓜的種類、料液比、提取溫度、時間、溶劑、pH值等提取條件以及提取方法等因素對提取多糖的結(jié)構(gòu)及活性都具有顯著影響[8-11]?？喙隙嗵堑奶崛》椒ê芏?，主要包括熱水浸提法、稀酸提取法、稀堿提取法、微波提取法、超聲波提取法、雙酶水解法等[12-17]，各主要方法比較與評價見表1。在實際運用中，有時會采取以上兩種或更多的方法聯(lián)合使用，如上述提到的纖維素酶協(xié)同超聲波提取法，一般聯(lián)合使用會比單獨使用效果更佳[12]。

表1 苦瓜多糖的提取方法及評價Table 1 Extraction methods for Momordica charantia polysaccharides

1.2 分離純化

1.2.1 初步純化

初步純化主要是脫去游離蛋白、脫色。脫蛋白主要包括Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法[7,18]。Sevag法[19]是利用蛋白質(zhì)在三氯乙烷等有機溶劑中變性的特點，使蛋白質(zhì)變性沉淀，而多糖不沉淀；此方法條件溫和，不會引起多糖的降解，缺點是效率低，需多次處理，多糖易損失。三氟三氯乙烷法[4]效率較高，但其極易揮發(fā)，不適合大量應(yīng)用。三氯乙酸法去除效果較好，缺點是反應(yīng)劇烈，條件要求高，且多糖容易發(fā)生降解，影響其生物活性。

有時制得的粗多糖干燥后顏色較深，需要進行脫色處理，否則可能會影響到苦瓜多糖的進一步純化及應(yīng)用。脫色主要為H2O2法、活性炭法、二乙氨乙基（diethylaminoethanol，DEAE）纖維素吸附法。其中H2O2最為常用，活性炭法在吸附過程中也會伴隨著多糖的損耗，對于弱堿性的DEAE纖維素吸附色素也有使用[20]。

1.2.2 深度純化

要了解苦瓜多糖的組成、相對分子質(zhì)量、化學(xué)結(jié)構(gòu)等，還需在提取粗多糖的基礎(chǔ)上對其進一步分離純化。主要方法包括分級沉淀法、季銨鹽沉淀法、膜分離法、凝膠柱層析法[21]。

分級沉淀法是由于不同苦瓜多糖在濃度不同的低級醇或酮中具有明顯不同的溶解度，從而對多糖進行分級沉淀[6]。季銨鹽沉淀法是通過長鏈季銨鹽沉淀酸性多糖，以分離酸性及中性多糖。膜分離法是利用不同的濾膜具有選擇性通過的性質(zhì)，來達到對多糖分離的目的。研究表明具有較強生理活性的苦瓜多糖相對分子質(zhì)量約在4×104～10×104之間[20]，所以，可以將在該范圍內(nèi)的超濾膜串聯(lián)起來組成研究所需的膜系統(tǒng)。凝膠柱層析法[13]則是根據(jù)多糖分子的形狀、大小不同而進行分離的，常用的凝膠主要有葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠。

2 苦瓜多糖的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特性

2.1 理化性質(zhì)

多糖的理化性質(zhì)與其相對分子質(zhì)量具有很大關(guān)系，要對多糖的理化性質(zhì)進行深入研究就必須對其相對分子質(zhì)量進行確定。要測定多糖的相對分子質(zhì)量，首要的任務(wù)就是對純度的鑒定。經(jīng)典的純度鑒定方法主要有比旋光度法、凝膠層析法和電泳法等，但此類方法誤差較大，一般都需多種方法同時進行驗證[22]。對于苦瓜多糖的純度鑒定，目前普遍采用高效凝膠滲透色譜法[23-24]，該法具有快速、準確等優(yōu)點。劉國凌等[25]將獲得的苦瓜多糖（Momordica charantia polysaccharide，MCP）經(jīng)DEAE纖維素柱離子交換柱層析分離得到MCP-A，MCP-A再經(jīng)Superdex G-100柱進行純化得到多糖MCP-A1組分，高效凝膠滲透色譜法檢測為均一組分。

在多糖相對分子質(zhì)量的測定中，多糖的提取方法、測定方法等的不同對其相對分子質(zhì)量的測定都具有一定的影響，測量結(jié)果與選用方法存在一定差異。目前，苦瓜多糖相對分子質(zhì)量的測定普遍采用凝膠滲透色譜法，其具有快速、準確度高和重現(xiàn)性好等優(yōu)點。劉國凌等[25]采用高效凝膠滲透色譜法對MCP-A1進行相對分子質(zhì)量測定，測定結(jié)果是相對分子質(zhì)量為93 577。吳勛貴等[23]采用熱水提取法得到苦瓜多糖，經(jīng)DEAE-32離子交換層析分離得到3 個多糖組分MCP1、MCP2、MCP3，進一步采用Sephacryl S-400凝膠層析進行分離，經(jīng)凝膠層析和高效液相色譜檢測表明，MCP1、MCP2為均一性多糖組分，高效液相凝膠色譜法測定兩者的相對分子質(zhì)量分別為1.16×106和7.45×105。

經(jīng)過分離純化后的苦瓜多糖，需定性分析。理化性質(zhì)通常需要進行碘-碘化鉀實驗、茚三酮反應(yīng)、Molish反應(yīng)，通過碘-碘化鉀實驗檢測分離純化后的多糖是否含有淀粉，茚三酮反應(yīng)檢測是否還有殘留的氨基酸或蛋白質(zhì)，Molish反應(yīng)檢測是否含糖[26-27]。陳紅漫等[28]將分離純化后的苦瓜多糖組分MCPIa進行碘-碘化鉀實驗、茚三酮反應(yīng)、Molish反應(yīng)，得出的結(jié)論為MCPIa中含糖但不含淀粉、氨基酸和蛋白質(zhì)；與董英等[27]的研究結(jié)果相一致。

2.2 結(jié)構(gòu)特性

研究苦瓜多糖的結(jié)構(gòu)特性，必先弄清多糖的組成。目前，普遍采用分析苦瓜多糖組成的方法有1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）衍生法[23]、薄層層析法[27]、氣相色譜法[29]、高效液相色譜法[28]等。就苦瓜多糖的組成與含量各文獻報道不盡一致，研究表明苦瓜多糖主要由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，因品種不同等因素影響可能含有鼠李糖、木糖等單糖。張德等[19]采用同種提取方法從5 種不同品系的苦瓜提取苦瓜多糖，結(jié)果各方法得出的提取率、中性多糖含量、酸性多糖含量等都不相同。目前國內(nèi)不同來源苦瓜多糖的相對分子質(zhì)量分布及單糖組成的研究見表2。

表2 苦瓜多糖的相對分子質(zhì)量及單糖組成Table 2 Molecular weights and monosaccharide composition of Momordica charantia polysaccharides

苦瓜多糖是一種復(fù)合雜多糖，多糖的單糖組成、比例、糖醛酸的種類、連接位置、側(cè)鏈中殘基與種類、其他取代基存在的情況、糖苷鍵構(gòu)型、糖環(huán)類型以及聚糖鏈等的不同使得對苦瓜多糖結(jié)構(gòu)的研究十分復(fù)雜。張德等[31]通過對苦瓜3 個自交系果實提取的苦瓜多糖進行紅外光譜分析，表明苦瓜多糖主要以α型和β型吡喃糖形式存在；董英等[27]通過對分離純化后的苦瓜多糖組分MCP2、MCP4進行紫外、紅外光譜分析，結(jié)果表明MCP2為半乳聚糖，且MCP2、MCP4都含有β-D-吡喃糖苷鍵。紅外分析苦瓜多糖組分MCPIa表明該組分為多聚糖，存在呋喃糖苷鍵，并且在紅外譜圖中含有硫酸酯鍵的吸收峰，說明該糖中含有硫酸基團[29]。

3 苦瓜多糖的生物活性

苦瓜多糖具有許多生物活性，目前，國內(nèi)外學(xué)者對其關(guān)注的焦點主要在降血糖作用、抗氧化作用、抑菌作用、抗腫瘤及增強免疫活性作用等幾大方面。

3.1 降血糖作用

糖尿病是一種代謝紊亂性疾病，正影響著越來越多人的健康。據(jù)預(yù)測，2025年全球糖尿病患者將突破3億，中國糖尿病患者將接近1億，現(xiàn)代研究表明苦瓜多糖具有顯著的降血糖功效[32-34]。其中，多糖的降血糖機制主要有[35-37]：修復(fù)或刺激胰島細胞，促進胰島素分泌；提高胰島素親和力或增加其受體數(shù)量，改善胰島素抵抗指數(shù)；抑制胰高血糖素分泌，抑制糖原分解，促進糖原的合成；抑制糖異生，增強糖利用，加速葡萄糖分解；抑制α-葡萄糖苷酶作用，延緩腸道內(nèi)葡萄糖的吸收；使血清中腫瘤壞死因子-α水平降低，增強葡萄糖轉(zhuǎn)運體表達；促進細胞的調(diào)亡。楊稅[38]分別將實驗小鼠隨機分成空白對照組，糖尿病模型，苦瓜多糖低、中、高劑量組，通過對實驗小鼠血糖的測定、胰島素水平的檢測及其抵抗指數(shù)的計算，得出的結(jié)論是苦瓜多糖能明顯降低血糖，使胰島素水平及其抵抗指數(shù)顯著升高，胰島素敏感指標降低。石雪萍等[39]在糖尿病小鼠上的研究結(jié)果顯示苦瓜水溶性多糖降血糖效果顯著，在劑量為500 mg/kg時，優(yōu)于甲糖寧。吳靈威等[40]研究發(fā)現(xiàn)苦瓜多糖的多個組分對胰島組織有保護和修復(fù)作用，并且指出這可能是苦瓜多糖降血糖的主要機理之一。苦瓜多糖與其他活性分子具有協(xié)同降血糖作用，等配比的苦瓜多糖與皂苷協(xié)同作用，效果顯著高于各自的單獨作用[41]。提取方法對苦瓜多糖的降血糖功效也有影響，通過比較水提法、堿提法提取的苦瓜多糖對鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠降糖效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)堿提多糖的降糖活性更好[6]。由此可見，苦瓜多糖提取方法、其他活性分子的作用都能夠影響到其降血糖功效。

3.2 抗氧化作用

苦瓜多糖具有很強的抗氧化性，Panda等[42]從苦瓜內(nèi)提出一種果膠多糖，并發(fā)現(xiàn)該糖具有激活脾細胞、胸腺細胞、巨噬細胞的作用和顯著的抗氧化性。據(jù)相關(guān)研究結(jié)果報道，Gong Juanjuan等[43]發(fā)現(xiàn)苦瓜多糖具有很好的神經(jīng)保護作用，其機制可能與它的抗氧化活性相關(guān)，在某些情況下通過其抗氧化性及抑制激酶的信號傳遞來實現(xiàn)這一功能；陳紅漫等[44]通過小鼠體外實驗也研究了苦瓜多糖抗氧化性與降血糖的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果顯示隨著苦瓜多糖抗氧化性的增加，小鼠的血糖值顯著降低，表明苦瓜多糖的抗氧化性在調(diào)節(jié)血糖這一方面也具有重要作用。植物多糖抗氧化性的測定一般包括對總還原能力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力、對超氧陰離子自由基清除能力、羥自由基清除能力的測定，Lin Yuyu等[45]研究發(fā)現(xiàn)苦瓜多糖對DPPH自由基和超氧陰離子自由基具有顯著的清除作用，其清除率隨多糖濃度的增加而增加。影響苦瓜多糖的抗氧化性因素不僅局限于多糖濃度的變化，有研究證實，硫酸化修飾能顯著提高苦瓜多糖的抗氧化能力[46]，這主要是因硫酸基的引入使得多糖具有聚陰離子特性，而這一特性正是生物活性改變的主要因素?？喙系姆N類也會對其清除羥自由基的能力產(chǎn)生影響[47]，在相同原料條件下，Liu Xin等[46]發(fā)現(xiàn)苦瓜多糖清除超氧陰離子自由基的能力比清除羥自由基能力明顯偏高，這可能是源于苦瓜多糖在對氫原子的提供以及其氧化反應(yīng)的發(fā)生中，氧化反應(yīng)更加容易發(fā)生，導(dǎo)致超氧陰離子自由基更加容易被清除。

3.3 抑菌作用

目前，研究多糖抑菌的主要方法有擴散法、稀釋法、比濁法，其中應(yīng)用最多的便是擴散法，管碟法和濾紙片法是其典型代表[48]。研究報道，苦瓜多糖具有很好的抑菌作用。張平平等[49]對苦瓜提取物的抑菌活性做了研究，通過比較苦瓜乙醇浸提物、粗多糖、純化多糖、粗蛋白、純化蛋白、粗皂苷、純化皂苷對藤黃八疊球菌的最低抑菌濃度，結(jié)果顯示，純化多糖與純化皂苷的抑菌效果最好。吳笳笛等[50]發(fā)現(xiàn)苦瓜多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、鼠傷寒沙門氏菌等具有很好的抑菌作用，半致死劑量分別為0.15、0.10、0.13、0.13 mg/mL，且以金黃色葡萄球菌最為明顯，對志賀氏菌、灰霉菌等效果不明顯。張文波等[51]采用濾紙片擴散法測定了不同質(zhì)量分數(shù)、不同pH值的苦瓜多糖對于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉、米曲霉的抑菌圈直徑，發(fā)現(xiàn)苦瓜多糖的抑菌效果與其濃度成正相關(guān)，受pH值影響顯著。

3.4 抗腫瘤及增強免疫活性

現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)一直關(guān)注于尋找低毒、高效的抗腫瘤藥物，而天然的植物活性多糖恰好可以迎合這一需求。蔡寅等[52]通過建立小鼠S180肉瘤、H22肝癌腫瘤模型觀察苦瓜多糖的抗腫瘤作用，發(fā)現(xiàn)小鼠腫瘤模型的生長受到不同劑量苦瓜多糖的抑制較明顯，并且腫瘤小鼠的胸腺指數(shù)和脾腺指數(shù)都有所增加，得出結(jié)論為苦瓜多糖具有較強的免疫增強活性并可能通過刺激淋巴細胞、增強巨噬細胞的活化來調(diào)節(jié)機體的免疫功能。張翠等[53]利用苦瓜多糖提高機體免疫功能的抗腫瘤機理和稀土直接殺死、殺傷腫瘤細胞的作用合成稀土-苦瓜多糖復(fù)合物，結(jié)果表明其具有體外腫瘤細胞增殖抑制作用，且高于單獨使用苦瓜多糖的情況，并且在研究中發(fā)現(xiàn)稀土-苦瓜多糖復(fù)合物與DNA之間會發(fā)生非嵌式相互作用，這也可能是其抗腫瘤作用的機理之一。在張利芳[5]對苦瓜多糖的免疫調(diào)節(jié)作用研究中，通過單核-巨噬細胞功能、體液免疫功能、細胞免疫功能、自然殺傷（natural killer，NK）細胞活性四方面測定苦瓜多糖對免疫低下小鼠的免疫作用，結(jié)果表明苦瓜多糖在這四方面均表現(xiàn)顯著。

4 結(jié) 語

近年來，伴隨著國內(nèi)外學(xué)者對苦瓜多糖研究的日益重視，苦瓜多糖的許多生物活性及功能逐漸進入大眾視野，國內(nèi)外學(xué)者在苦瓜多糖的提取、分離純化、降血糖、抗氧化等方面做了大量的研究，也取得了很大的進展。但苦瓜多糖作為一種極具開發(fā)價值的生物活性物質(zhì)，就目前的研究成果而言，還存在很多亟待解決的問題?？喙隙嗵堑纳锘钚砸呀?jīng)被發(fā)掘出來了，但其具體的作用機制有待進一步研究，并且在苦瓜多糖的各組分分析鑒定方面還需進一步完善。苦瓜多糖的結(jié)構(gòu)分析還不夠系統(tǒng)和深入，尤其是對其結(jié)構(gòu)與功能方面的關(guān)系鮮有報道，苦瓜多糖藥理活性的應(yīng)用及其工業(yè)化的進程在未來還有一段路程，苦瓜多糖的研究價值極大，前景可觀。

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Recent Progress in Extraction, Chemical Structure and Bioactivities of Momordica charantia Polysaccharides

GONG Bin1,2, SHEN Mingyue1,*, HE Lingling1,2, XIE Jianhua1,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2. College of Light Industry and Food Science, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

Momordica charantia has been used historically as a herbal medicine and vegetable for thousands of years. Modern phytochemical and pharmacological experiments have proved that polysaccharide is one of its major active components. In recent decades, Momordica charantia polysaccharide, as a complex heteroglycan, has attracted a great deal of attention in the biomedical field due to its biological activities. In this paper, the latest progress in the extraction, separation, physicalchemical properties, structural characteristics and bioactivities of Momordica charantia polysaccharides is reviewed systematically, and future prospect is also discussed.

Momordica charantia polysaccharide; separation and purification; physicochemical properties; structure; bioactivity

TS252.7

A

1002-6630（2015）21-0279-05

10.7506/spkx1002-6630-201521052

2015-05-17

國家自然科學(xué)基金面上項目（31471702）；江西省自然科學(xué)基金青年重大項目（20152ACB21004）

龔斌（1993—），男，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵工程。E-mail：1356553728@qq.com

*通信作者：申明月（1984—），女，助理研究員，碩士，研究方向為食品營養(yǎng)與安全。E-mail：shenmingyue1107@ncu.edu.cn

謝建華（1982—），男，副研究員，博士，研究方向為食品碳水化合物結(jié)構(gòu)與功能。E-mail：jhxie@ncu.edu.cn