羅非魚魚皮膠原多肽對體外腸道腫瘤的影響

江虹銳，邵 勇，劉小玲，白 洋，米順利，楊 莉

（1.廣西醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，廣西 南寧 530021；2.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西 南寧 530004；3.廣東百維生物科技有限公司，廣東 化州 525100；4.百洋水產(chǎn)集團股份有限公司，廣西 南寧 530007）

羅非魚魚皮膠原多肽對體外腸道腫瘤的影響

江虹銳1,2，邵 勇2，劉小玲2，白 洋3，米順利4，楊 莉1

（1.廣西醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，廣西 南寧 530021；2.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西 南寧 530004；3.廣東百維生物科技有限公司，廣東 化州 525100；4.百洋水產(chǎn)集團股份有限公司，廣西 南寧 530007）

目的：體外研究羅非魚魚皮膠原多肽對人結(jié)腸癌細胞系LoVo增殖能力的影響，并初步探討其作用機理。方法：體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌LoVo細胞，噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tertrazolium bromide，MTT）法檢測羅非魚魚皮膠原多肽對細胞增殖的影響；熒光探針染色法觀察細胞膜及核的變化；激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）表達；比色法檢測細胞線粒體呼吸鏈酶復合物Ⅰ和Ⅲ的活性。結(jié)果：羅非魚魚皮膠原多肽對LoVo細胞的增殖具有一定的抑制作用，當質(zhì)量濃度為100 mg/mL、作用48 h時，抑制率達到55.03%（P＜0.05）；與空白對照組相比，經(jīng)膠原多肽作用后，LoVo細胞核濃縮，細胞膜出現(xiàn)不完整，細胞凋亡；且細胞內(nèi)活性氧水平表達顯著增加（P＜0.05），細胞內(nèi)線粒體呼吸鏈復合物Ⅲ的活性顯著降低（P＜0.05），但對線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ的活性無影響。結(jié)論：羅非魚魚皮膠原多肽對人結(jié)腸癌細胞具有一定的增殖抑制作用，可能與抑制線粒體呼吸鏈復合物Ⅲ活性，使胞內(nèi)ROS水平增加，破壞細胞膜形態(tài)有關(guān)。

羅非魚魚皮；膠原多肽；腸道腫瘤；活性氧；線粒體呼吸鏈復合物

膠原多肽是膠原蛋白或明膠經(jīng)蛋白酶、酸、堿等一定外部條件降解后得到的分子質(zhì)量約為500～30 000 D的產(chǎn)物[1]。膠原多肽的來源較多，主要有豬皮、豬骨、牛皮、魚皮、魚鱗等，加工工藝分為酸水解[2]、堿水解、高溫熱解以及酶解[3]。李少華等[4]以新鮮豬皮為原料，利用木瓜蛋白酶在60 ℃、pH 5的條件下得到膠原多肽水解度為14.91%。戴丹琴等[5]利用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶按酶活力比3∶1復合，得到的牛皮膠原蛋白的水解度可達 32.02%。周亮等[6]研究了以熱水法和酶解法相結(jié)合制備魚鱗膠原多肽，最終水解度達23.17%。由于不同的降解條件獲得的膠原多肽氨基酸殘基序列組成及空間結(jié)構(gòu)各不相同，使得其具有不同的生理活性，如抗氧化[7]、抗菌[8]和免疫調(diào)節(jié)[9]等。王茵等[10]研究了經(jīng)復合酶水解制備出的羅非魚皮膠原多肽降血壓作用，其中高劑量組血壓下降30.37 mmHg，并得出魚皮膠原多肽對原發(fā)性高血壓大鼠的降血壓效果顯著，長期飼喂還有穩(wěn)定血壓的功效的結(jié)論。殷娟娟等[11]以酶解脫鈣羅非魚鱗為原料制得膠原多肽，并證明其具有明顯的抗疲勞活性。到目前為止，關(guān)于魚皮膠原多肽抗腫瘤作用的報道較為少見。

結(jié)腸癌是腸道腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一。結(jié)腸癌的發(fā)病與環(huán)境因素、生活和飲食習慣明顯相關(guān)，隨著我國現(xiàn)代化程度和生活水平的提高，國民的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生很大變化，精細糧食和高蛋白高脂肪食物的攝入不斷增加，結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[12]。因此，研究和開發(fā)預防腸道腫瘤的功能性食品具有很好的現(xiàn)實意義。本研究探討羅非魚魚皮膠原多肽在體外對人結(jié)腸癌細胞系LoVo的增殖影響及作用機理，為羅非魚下腳料的利用、膠原多肽產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚魚皮膠原多肽，廣東百維生物科技有限公司提供，分子質(zhì)量≤6 000 D。其主要制作工藝為：魚皮→脫灰→熱酸處理→酶解→脫色→膜過濾→濃縮→干燥→產(chǎn)品。結(jié)腸癌細胞系LoVo，購自北京協(xié)和細胞資源中心。

F12K培養(yǎng)基 美國Hyclone公司；小牛血清 四季青有限公司；噻唑藍（methylthiazolyldiphenyltertrazolium bromide，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、熒光探針Hochest33342、CM-DiI、線粒體超氧化物指示劑MitoSOX-RE 美國Life Technologies公司；線粒體分離試劑盒、線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ/Ⅲ試劑盒 美國Genemed公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒 北京索萊寶有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Forma 3111 CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；Synergy H4 Hybrid全功能微孔板檢測儀 美國Biotek公司；A1激光共聚焦顯微鏡 日本Nikon公司；FASscan流式細胞儀美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 LoVo細胞的培養(yǎng)

人結(jié)腸癌LoVo細胞在含有1%的青鏈霉素和20%新生胎牛血清的F12K培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2。當培養(yǎng)瓶中的細胞長滿瓶底的60%～80%時，為對數(shù)生長期。用胰蛋白酶消化2～3 min后，在光學倒置顯微鏡下觀察細胞突起、縮回，細胞間隙增大、近乎縮成圓形時，加入含有血清的F12K培養(yǎng)基終止消化，用吸管反復吹打，直至鏡下觀察形成單細胞懸液，取來血細胞計數(shù)板，計算細胞數(shù)量。按實驗要求調(diào)細胞濃度。

1.3.2 膠原多肽樣品的配制

稱取一定量羅非魚魚皮膠原多肽，加入F12K培養(yǎng)基溶解配制成終質(zhì)量濃度為1 g/mL的膠原多肽溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌，于4 ℃保存?zhèn)溆谩嶒炃?，用F12K培養(yǎng)基分別稀釋成不同質(zhì)量濃度梯度的膠原多肽溶液。以不含羅非魚魚皮膠原多肽的F12K培養(yǎng)基為對照樣品。

1.3.3 細胞增殖抑制作用分析

將100 μL處于對數(shù)生長期的LoVo細胞按1×104cells/mL接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，分別加入含有10、25、50、100、150、200 mg/mL羅非魚魚皮膠原多肽的F12K培養(yǎng)基，作用時間分別為24、48、72 h。作用后，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清。然后每孔加入100 μL DMSO，室溫下低速振蕩5 min，使細胞中產(chǎn)生的紫色結(jié)晶物（甲臜，formazan）充分溶解。全功能微孔板檢測儀490 nm波長處測量各孔的光密度（OD）值。以F12K培養(yǎng)基作用組為空白對照。每組設(shè)3 個復孔。

1.3.4 細胞膜、核的形態(tài)觀察

將LoVo細胞以1×104cells/mL的密度接種至35 mm玻底培養(yǎng)皿中，加入含20%小牛血清的F12K培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)24 h后，棄去上清。分別加入1 mL含100 mg/mL的羅非魚魚皮膠原多肽的F12K培養(yǎng)基作用48 h，棄去培養(yǎng)液。用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗，除去未貼壁的細胞和殘留培養(yǎng)液，加入1 mL含有5 μL CM-DiI和1 μg Hochest 33342的F12K培養(yǎng)基，37 ℃孵育15 min后，PBS清洗兩遍，于激光共聚焦顯微鏡觀察LoVo細胞膜（λex/λem=553 nm/570 nm）和細胞核（λex/λem=350 nm/460 nm）形態(tài)。實驗以F12K培養(yǎng)基作用組為空白對照。

1.3.5 流式細胞術(shù)檢測LoVo細胞的凋亡

將LoVo細胞以1×104cells/mL的密度接種至6 孔細胞培養(yǎng)板，加入含20%小牛血清的F12K培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)培養(yǎng)24 h后，棄去上清。分別加入2 mL含100 mg/mL的羅非魚魚皮膠原多肽的F12K培養(yǎng)基作用48 h。胰酶消化細胞，1 000 r/min離心5 min收集細胞沉淀。按照AnnexinVFITC/PI試劑盒說明，對細胞進行染色，2 h內(nèi)上流式細胞儀分析。實驗以F12K培養(yǎng)基作用組為空白對照。

1.3.6 細胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）表達觀察

使用線粒體超氧化物指示劑MitoSOX-RED檢測細胞中產(chǎn)生的ROS。將LoVo細胞以1×104cells/mL的密度接種至35 mm玻底培養(yǎng)皿中，加入20%小牛血清的F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，棄去上清。分別加入1 mL/皿含100 mg/mL的羅非魚魚皮膠原多肽的F12K培養(yǎng)基作用48 h，棄去培養(yǎng)液。用PBS除去未貼壁的細胞和殘留培養(yǎng)液，將各皿中的細胞孵育在2 mL含有5 μmol/L MitoSOX-RED的HBSS/Ca/Mg溶液中30 min，37 ℃，磷酸鹽緩沖液清洗兩遍，在λex/λem=510 nm/580 nm處使用激光共聚焦顯微鏡觀察LoVo細胞ROS表達。實驗以F12K培養(yǎng)基作用組為空白對照。

1.3.7 細胞線粒體呼吸鏈復合酶的水平檢測

將LoVo細胞以1×104cells/mL的密度接種至6 孔細胞培養(yǎng)板中，加入20%新生胎牛血清的F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，棄去上清，加入2 mL含100 mg/mL的羅非魚魚皮膠原多肽的F12K培養(yǎng)基作用48 h，棄去培養(yǎng)液。胰酶消化細胞，1 000 r/min離心10 min收集細胞沉淀。使用線粒體分離試劑盒提取LoVo細胞的線粒體，于－70 ℃保存。使用線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅲ試劑盒檢測羅非魚魚皮膠原多肽對LoVo細胞作用后，細胞線粒體呼吸鏈復合酶Ⅰ（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-輔酶Q還原酶，reduced nicotinamide adenine dinucleotide-coenzyme Q reductase，NADH-Q reductase）和Ⅲ（輔酶Q-細胞色素c還原酶, reduced coenzyme Q-cytochrome c reductase，CoQH2-Cyt c reductase）的水平。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計及作圖采用SPSS 13.0、Sigma Plot11.0軟件，所有實驗重復3 次，結(jié)果以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅非魚魚皮膠原多肽對腸道腫瘤細胞的增殖影響

由圖1可知，羅非魚魚皮膠原多肽對LoVo細胞的抑制率隨膠原多肽質(zhì)量濃度的增加而增大，但隨著作用時間的延長，其抑制率發(fā)生變化。作用24 h，膠原多肽達到最大抑制率的質(zhì)量濃度為150 mg/mL，抑制率為（37.00±0.02）%；作用48 h，膠原多肽達到最大抑制率的質(zhì)量濃度為200 mg/mL（抑制率（59.69±0.02）%）；作用72 h，膠原多肽達到最大抑制率的質(zhì)量濃度為150 mg/mL，（抑制率為（46.15±0.03）%）。隨著作用時間的延長，相同作用質(zhì)量濃度達到細胞最佳抑制率的作用時間為48 h。100 mg/mL與150 mg/mL的膠原多肽在不同作用時間的抑制率較為接近。從抑制效果（抑制率超過50%）和適用性考慮，選擇膠原多肽質(zhì)量濃度為100 mg/mL、作用時間48 h（抑制率55.03%，P＜0.05）來研究膠原多肽對LoVo細胞增殖影響及作用機理。

圖1 膠原多肽在不同質(zhì)量濃度和時間對LoVo細胞的作用Fig.1 Effects of collagen peptides on the growth inhibition of LoVo cells at different concentrations and treatment times

2.2 羅非魚魚皮膠原多肽對腸道腫瘤細胞核、膜影響的形態(tài)學觀察

相對于空白對照組，經(jīng)100 mg/mL、48 h膠原多肽作用后LoVo細胞核（藍色）出現(xiàn)核濃縮（圖2A）；細胞膜（紅色）著色不均勻，大多數(shù)細胞膜形態(tài)不完整（圖2B）。從結(jié)果中推測，羅非魚魚皮膠原多肽作用后腸道腫瘤細胞核出現(xiàn)濃縮，且細胞膜受到破壞。

圖2 膠原多肽對LoVo細胞膜和核形態(tài)的影響（160×）Fig.2 Membrane and nuclear morphology of LoVo cells treated by collagen peptides (160×)

2.3 羅非魚魚皮膠原多肽對腸道腫瘤細胞的凋亡作用

圖3為LoVo細胞經(jīng)FITC-AnnexinV和PI標記后，流式細胞儀分析細胞凋亡的實驗結(jié)果。其中Q1域表示許可范圍內(nèi)的檢測誤差，Q2域表示壞死細胞和凋亡晚期細胞，Q3域表示正常細胞，Q4域表示早期凋亡細胞。除了細胞自身的發(fā)生程序性死亡外，與空白對照組（Q4=7.4%）相比，膠原多肽作用組對LoVo細胞有促凋亡作用（Q4=12.6%）。膠原多肽對LoVo細胞增殖活性的抑制可能與誘導凋亡有關(guān)。

圖3 膠原多肽對LoVo細胞凋亡的誘導作用Fig.3 Effect of collagen peptides on the induction of apoptosis in LoVo cells

2.4 羅非魚魚皮膠原多肽對腸道腫瘤細胞ROS水平的影響

圖4 膠原多肽對LoVo細胞中ROS表達的影響（160×）Fig.4 Expression of ROS in LoVo cells treated by collagen peptides (160×)

如圖4所示，鮮艷的深紅色為ROS，ROS大多數(shù)分布在細胞核，一部分表達在細胞間?？瞻讓φ战M可見完整的細胞輪廓；與空白對照組相比，經(jīng)100 mg/mL、48 h羅非魚魚皮膠原多肽作用的LoVo細胞數(shù)量減少，但ROS表達量顯著增加。以視野中每104個LoVo細胞完全發(fā)熒光為100%計算LoVo細胞ROS相對熒光密度?？瞻讓φ战M每104個LoVo細胞ROS相對熒光密度為（10.39±0.04）%；膠原多肽作用組相對熒光密度為（18.24±1.02）%（P＜0.05）。此外，通過ROS在LoVo細胞中的分布位置觀察，發(fā)現(xiàn)經(jīng)膠原多肽作用后的LoVo細胞內(nèi)ROS幾乎完全覆蓋了細胞。該結(jié)果說明羅非魚魚皮膠原多肽對LoVo細胞增殖的抑制作用可能是通過增加細胞內(nèi)的ROS水平造成活性氧損傷引起的。

2.5 羅非魚魚皮膠原多肽對腸道腫瘤細胞線粒體呼吸鏈復合物活性的影響

如圖5A所示，與空白對照組中線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ的活力（（6.85±0.92）μmol NADH/（min·mg））相比，羅非魚魚皮膠原多肽作用組對LoVo細胞的線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ的活性有輕微的增強作用（（7.22±0.33） μmol NADH/（min·mg）），但差異不顯著，無法判斷羅非魚魚皮膠原多肽是否對LoVo細胞線粒體復合物Ⅰ有影響。如圖5B所示，與空白對照組線粒體呼吸鏈復合物Ⅲ的活力（19.02±2.90）μmol CoQH2/（min·mg）相比，羅非魚魚皮膠原多肽作用組顯著抑制了復合物Ⅲ的活力（（10.97±0.64） μmol CoQH2/（min·mg），P＜0.05）。從該結(jié)果中推測，羅非魚魚皮膠原多肽對腸道腫瘤細胞增殖抑制可能與其抑制細胞內(nèi)線粒體呼吸鏈復合酶Ⅲ活性有關(guān)。

圖5 膠原多肽對LoVo細胞線粒體呼吸鏈復合物活性的影響Fig.5 Effect of collagen peptides on the activity of mitochondrial complexes in LoVo cells

3 討 論

羅非魚是我國主要的淡水經(jīng)濟魚種，隨著我國水產(chǎn)品加工業(yè)的發(fā)展，特別是對魚片加工，具有大量的魚皮、魚骨等下腳料資源。利用魚皮、魚骨等副產(chǎn)品提取膠原蛋白、膠原多肽等產(chǎn)品，在食品、化妝品和保健品領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景，大大提高了水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物的產(chǎn)品附加值。因此，具有一定生物活性的膠原多肽對于功能性食品的開發(fā)可提供一定理論基礎(chǔ)。

膠原蛋白經(jīng)水解后可產(chǎn)生分子質(zhì)量大小、氨基酸組成、空間結(jié)構(gòu)不同的肽段，這些水解物具有多種生物活性，如抗高血壓、抗菌、抗炎癥和抗氧化等。在抗腫瘤方面，Monboisse等[13]研究發(fā)現(xiàn)從膠原蛋白中得到的一些分解產(chǎn)物對多種荷瘤鼠模型的腫瘤生長有很好的抑制作用；Popov等[14]發(fā)現(xiàn)經(jīng)酶水解后的海參膠原蛋白能夠延長腹水瘤小鼠的存活期；Pasco等[15]發(fā)現(xiàn)Ⅳ型膠原經(jīng)水解后的部分肽段可控制黑色素瘤的浸潤，其作用機制與抑制腫瘤細胞金屬蛋白酶（metalloprotinases，MMP）的表達和活性有關(guān)。膠原蛋白的來源多來自于豬皮、豬骨、牛皮、魚皮、魚鱗、鼠尾等，關(guān)于魚皮膠原蛋白及其水解產(chǎn)物在抗腫瘤方面的生物活性的報道較少。本研究中，MTT實驗結(jié)果表示，與對照組相比，羅非魚魚皮膠原多肽對腸道腫瘤LoVo細胞的生長有顯著的抑制作用；通過激光共聚焦掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)膠原多肽作用后，LoVo細胞出現(xiàn)核濃縮，屬于凋亡細胞的典型特征。細胞凋亡早期位于細胞膜內(nèi)側(cè)的磷酯酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）遷移至細胞外側(cè)，可以利用細胞凋亡時細胞膜成分的改變來檢測細胞的凋亡情況[16]。AnnexinV-PI染色法既可檢測腫瘤的早期凋亡，又可區(qū)分凋亡與死亡細胞，本研究通過流式細胞儀、AnnexinV-PI染色法進一步檢測膠原多肽對LoVo細胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，羅非魚魚皮膠原多肽促進了LoVo細胞的早期凋亡。

細胞凋亡信號通路主要有兩種：一種是死亡受體途徑（外源性途徑），另一種是線粒體途徑（內(nèi)源性途徑）。其中，凋亡的線粒體途徑包括線粒體膜通透化、細胞色素c的釋放、電子傳遞的改變、細胞ROS的改變和相關(guān)信號蛋白和信號因子的表達變化[17]，繼而導致細胞核濃縮、細胞膜內(nèi)側(cè)PS外翻、細胞膜泡狀化。來源于線粒體的ROS水平對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各個階段對腫瘤的存活和凋亡有重要影響[18]。腫瘤細胞中ROS的表達高于正常細胞[19]，且腫瘤細胞更容易受到氧化應(yīng)激的傷害。低劑量的ROS會促進細胞生長[20]，而增加細胞內(nèi)ROS水平可誘導細胞凋亡[21]。有研究表明羅非魚膠原蛋白經(jīng)過胃腸道消化酶水解后，其1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力增加，表現(xiàn)出較好的抗氧化活性[22]。目前，膠原多肽的抗氧化活性大多基于體外的化學分析檢測，其對腫瘤細胞內(nèi)ROS表達的抗氧化作用，還未見報道。本研究的結(jié)果表明，與對照組相比，經(jīng)過羅非魚皮膠原多肽作用后的LoVo細胞內(nèi)ROS水平表達顯著增強（P＜0.05），其對LoVo細胞的凋亡作用可能與ROS增加有關(guān)。為了尋找膠原多肽促進LoVo細胞內(nèi)ROS水平升高的原因，本研究進一步檢測了細胞線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ和Ⅲ的活性。在腫瘤的生長過程中，常伴隨著細胞線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）突變的發(fā)生。而mtDNA突變會導致呼吸鏈復合物Ⅰ或Ⅲ缺乏，使呼吸鏈中途的“電子漏”將氧直接接受單電子生成ROS[23]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羅非魚魚皮膠原多肽顯著的抑制了復合物Ⅲ的活性，但對復合物Ⅰ的活性作用效果不明顯。結(jié)果提示，羅非魚魚皮膠原多肽誘導LoVo細胞ROS表達增加的原因可能與抑制線粒體復合物Ⅲ活性有關(guān)。此外，由于細胞膜、線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等生物膜均由磷脂雙分子層及膜蛋白構(gòu)成，對ROS敏感，大量的ROS可損害細胞膜脂質(zhì)，線粒體內(nèi)膜[24]。本研究中，羅非魚魚皮膠原多肽經(jīng)作用后的LoVo細胞內(nèi)ROS的水平顯著增強（P＜0.05），可能是造成細胞膜著色不均一、結(jié)構(gòu)破壞的原因。羅非魚魚皮膠原多肽對LoVo細胞凋亡作用機制、以及對腫瘤細胞的生長抑制是否與其抗氧化活性有關(guān)，有待于進一步研究。

4 結(jié) 論

本實驗通過體外實驗初步探究了羅非魚膠原多肽對腸道腫瘤的抑制機制。結(jié)果表明，羅非魚魚皮膠原多肽對結(jié)腸癌細胞LoVo的增殖具有抑制能力，從形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)，細胞核濃縮、細胞膜受到破壞；從流式細胞術(shù)觀察發(fā)現(xiàn)，膠原多肽作用后對結(jié)腸癌細胞具有促凋亡作用；此外，經(jīng)膠原多肽作用后，細胞內(nèi)ROS表達顯著增強（P＜0.05），這可能與其抑制細胞線粒體呼吸鏈復合物Ⅲ活性有關(guān)。膠原多肽對LoVo細胞抑制作用機理有待進一步研究。

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Effects of Collagen Peptides from Tilapia Skin on Colon Carcinoma in Vitro

JIANG Hongrui1,2, SHAO Yong2, LIU Xiaoling2, BAI Yang3, MI Shunli4, YANG Li1
(1. Public Health of Guangxi Medicine University, Nanning 530021, China; 2. College of Light Industry and Food Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China; 3. Guangdong Baiwei Biological Technology Co. Ltd., Huazhou 525100, China; 4. Baiyang Aquatic Group, Inc., Nanning 530007, China)

Objective: To investigate the effects of collagen peptides from tilapia skin on the proliferation ability of human colon carcinoma cell line LoVo in vitro and its possible mechanism. Methods: The inhibitory effects of collagen peptides from tilapia on the proliferation of LoVo cells were observed by MTT assay. Fluorescent staining method was used to analyze the effect on cell membrane and nucleus. Laser confocal microscopy was used to examine reactive oxygen species (ROS) expression in LoVo cells. The activities of mitochondrial respiration chain complex I and III were analyzed by colorimetry. Results: Collagen peptides from tilapia skin showed certain inhibitory effect on the proliferation of LoVo cells. After being treated by 100 mg/mL of collagen peptides for 48 h, the growth inhibitory effect rate reached 55.03% (P ＜ 0.05). Compared with the control group, the nucleus of LoVo cells was shrunk and cell membrane was destructed after being treated by collagen peptides. Meanwhile, the ROS level was significantly increased (P ＜ 0.05). Collagen peptides significantly inhibited the activity of complex III. Conclusion: Collagen peptides from tilapia skin have inhibitory effects on the proliferation of human colon carcinoma cells, which is probably associated with the inhibited activity of mitochondrial respiration chain complex III in LoVo cells, promoting ROS expression and destructing the cell membrane in LoVo cells.

tilapia skin; collagen peptides; colon carcinoma; reactive oxygen species (ROS); mitochondrial respiratory chain complex

TS254.6

A

1002-6630（2015）21-0196-05

10.7506/spkx1002-6630-201521037

2015-01-06

國家自然科學基金青年科學基金項目（31201349）；茂名市科技計劃項目（2012A01005）；

廣西醫(yī)科大學博士后科研資助項目（20121018）

江虹銳（1984－），女，副教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)與安全。E-mail：jianghr1984@163.com