豬偽狂犬病與豬圓環(huán)病毒病混合感染的PCR診斷

盧 琴，李明波，彭先文，宋忠旭，梅書棋

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430064）

豬偽狂犬病與豬圓環(huán)病毒病混合感染的PCR診斷

盧 琴，李明波，彭先文，宋忠旭，梅書棋*

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430064）

為了解豬場20日齡內(nèi)的仔豬發(fā)病死亡的病因，對2頭病豬的肺臟、淋巴結(jié)、腦等組織進行病原學(xué)診斷。對2頭病豬的組織樣進行PCV2-ORF2基因、PRV-gE基因的PCR擴增。結(jié)果表明樣品均能擴增出PCV2-ORF2基因、PRV-gE基因的特異性條帶，這與預(yù)期的片段大小相符，說明這2頭仔豬的病因為豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬偽狂病病毒野毒（PRV-gE）混合感染。這為豬場疾病的診斷和治療提供實踐與理論依據(jù)，對分析豬場接種疫苗產(chǎn)生免疫抗體的效果進行評估，從而不斷地制定并完善免疫程序。

豬；PCV2，PRV-gE；PCR

豬圓環(huán)病毒病與豬瘟、藍耳病并稱為中國養(yǎng)豬業(yè)“三座大山”。豬圓環(huán)病毒有2個血清型，即1型(PCV1)和2型(PCV2)。其中豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus 2，PCV2)引發(fā)仔豬斷奶多系統(tǒng)衰弱綜合征和豬的皮炎與腎病綜合征等疾病，主要侵害機體的免疫系統(tǒng)，可以造成機體的免疫抑制[1]。PCV2及其相關(guān)的豬病已在全世界范圍內(nèi)發(fā)生和流行，發(fā)病率可高達60%，死亡率達10%～30%。

偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起多種家畜和野生動物共患的以發(fā)熱、奇癢(豬除外)和腦脊髓炎為主要特征的一種急性傳染病。PRV可以感染各個年齡階段的豬，母豬臨床表現(xiàn)為流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎[2]；仔豬臨床表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、消瘦、死亡，15日齡內(nèi)的仔豬病死率可達100%；但對于育肥豬的臨床癥狀不明顯，僅僅表現(xiàn)為生長抑制及呼吸系統(tǒng)疾病[3]。至今為止發(fā)現(xiàn)PRV基因組上共有70種不同的基因[4]。其中g(shù)E基因是PRV最重要的毒力基因，與PRV對于宿主的致病力密切相關(guān)；gB基因主要參與病毒的復(fù)制。

本研究建立了針對PCV2-ORF2基因和PRV-gE基因的PCR鑒定，為進一步開展PRV、PCV的防控提供了重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料病料來源于湖北某豬場20日齡左右病豬的肺臟、腦、淋巴結(jié)等組織。

1.1.2 主要試劑DNA DL2000 Marker、DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠、Taq DNA聚合酶均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物合成圓環(huán)病毒ORF2基因引物序列：F：5'-AATC CGCTATTTACCCAGTGG-3'，R：5' -GCTGTAAACCTCGCCACT-3'，預(yù)期擴增片段大小為494 bp。

偽狂犬病毒gE基因引物序列：F：5'-GACGAGCCCCGCTTCCAC GCGA-3'，R：5'-CACCGGTCGC GAGCAGCGGCT-3'，預(yù)期擴增片段大小為366 bp。

最后，PCV2ORF2基因和PRVgE基因引物由上海生工合成。

1.2.2 DNA的提取按照DNA提取說明書進行提取。

1.2.3 PCR檢測條件以提取的基因組DNA為模板進行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)后，72 ℃后延伸5 min。

2 結(jié)果

2.1 PCV2型ORF2基因的PCR擴增結(jié)果

以所提取的DNA為模板，進行PCV2ORF2基因的PCR擴增。取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，得到了預(yù)期的494 bp的DNA條帶，結(jié)果見圖1。

2.2 PRV gE基因的PCR擴增結(jié)果

以所提取的DNA為模板，進行PRV gE基因的PCR擴增。取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，得到了預(yù)期的366 bp的DNA條帶，結(jié)果見圖2。

2.3 PCR擴增結(jié)果

圖1 PCV2-ORF2基因的PCR擴增結(jié)果

圖2 PRV g'E基因的PCR擴增結(jié)果

通過PCR檢測結(jié)果可知，病豬已感染了豬偽狂犬病病毒野毒和圓環(huán)病毒。結(jié)果見表1。

3 討論

PCV2感染后導(dǎo)致豬的機體免疫力或應(yīng)答能力下降，使其疫苗免疫效果降低或喪失；產(chǎn)生的免疫抑制易引發(fā)其他病原的混合感染或繼發(fā)感染，導(dǎo)致豬的生產(chǎn)性能下降甚至死亡[5]。在湖北、廣東、北京、天津、吉林、山東、湖南、河南等地區(qū)的大型豬場發(fā)現(xiàn)有母豬流產(chǎn)、死胎及木乃伊胎等疑似PRV的現(xiàn)象，也伴有初生仔豬大批死亡的病例[6-7]，當(dāng)前大多數(shù)豬場采用gE缺失疫苗進行免疫，但是由于PRV野毒潛伏期較長，在育肥豬體內(nèi)不表現(xiàn)出臨床癥狀，隨時排毒給妊娠母豬或仔豬，這就導(dǎo)致了免疫程序的復(fù)雜性及不確定性；況且PRV疫苗為抗感染免疫疫苗，對感染PRV的豬免疫后可減輕其臨床癥狀、緩解病情，盡可能的挽回經(jīng)濟損失，卻不能徹底殺滅病毒，也不能清除潛在感染。所以，對于豬場有必要定期地對整個豬群進行監(jiān)測，以更好地制定免疫計劃。

表1 PCR擴增結(jié)果表

[1] Segalés J，Rosell C，Domingo M，et al.Pathological findings associated with naturally acquired porcine circo virus type2 associated disease[J].Vet Microbiol，2004，98：137-149.

[2] Perez L，Perera C，F(xiàn)rias M，et al.A multiple SYBR Green I-based realtime PCR system for the simultaneous detection of porcine circovirus type 2，porcine parvovirus，pseudorabies virus and Torque tenosus virus 1 and 2 in pigs[J].Journal of Virological Methods，2012，179(1)： 233-241.

[3] Yang X， Forier K， Steukers L，et al.Immobilization of pseudorabies virus in porcine tracheal respiratoiy mucus revealed by single particle tracking[J].PloS One，2012，7(12)：51-54.

[4] Ferrari M，Brack M，Romanelli T，et al.A study of the ability of a TK-negative and gl/gEnegative pseudorabies virus (PRV) mutant inoculated by different routes to protect pigs against PRV infection[J]. Journal of Veterinary Medicine，2000，47(10)：753-762.

[5] 羅黛青.豬圓環(huán)病毒病的診斷與防控對策[J].畜禽業(yè)，2015， 309 (1)：12-13.

[6] 彭金美，安同慶，趙鴻遠，等.豬偽狂犬病病毒新流行株的分離鑒定及抗原差異性分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2013，35(1)： 1-4.

[7] 隋慧，楊金生.豬偽狂犬病毒LX株的分離與鑒定[J].中國畜牧獸醫(yī)，2013，40(6)：226-229.

2015-04-04）

國家科技支撐計劃項目(2011BAD28B01)、國家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(CARS-36)、湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心創(chuàng)新團隊項目(2011-620-001-003)、湖北省高端人才引領(lǐng)培養(yǎng)計劃、湖北省公益性科技研究(2013BBB15)

盧琴（1989-），女，湖南常德人，研究實習(xí)員，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)病理學(xué)與食品安全評價。通訊作者：梅書棋。