應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化香菇菌糠多糖提取工藝*

趙春艷，熊 勇，高觀世，吳素蕊**

（1.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2.云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國家民委－教育部重點實驗室，云南 昆明 650500）

〈貯運加工〉

應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化香菇菌糠多糖提取工藝*

趙春艷1，熊 勇2，高觀世1，吳素蕊1**

（1.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2.云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國家民委－教育部重點實驗室，云南 昆明 650500）

為優(yōu)化香菇（Lentinus edodes）菌糠多糖的提取工藝，首先采用單因素試驗，再根據(jù)中心組合試驗Box-Behnken的設(shè)計原理，采用三因素三水平的響應(yīng)面法分析確定香菇菌糠多糖提取各工藝條件的影響因素。香菇菌糠多糖提取的最佳工藝條件為提取溫度84℃、提取時間6 h、水料比55:1（mL·g-1），多糖最大提取率5.61%。響應(yīng)面優(yōu)化法提供的參數(shù)準(zhǔn)確可靠，按該工藝能夠提高香菇菌糠的多糖提取率。

香菇；菌糠；多糖；響應(yīng)面分析法

香菇 [Lentinus edodes(Berk.)Sing.]是傘菌綱（Agaricomycetes） 傘菌目 （Agaricales)光茸菌科（Omphalotaceae） 香菇屬（Lentinus） 的食藥兼用大型真菌[1]，是廣泛栽培品種。香菇多糖（lentinan，LNT）具有明顯的抗HIV、抗腫瘤、抗感染、改善免疫系統(tǒng)功能、調(diào)節(jié)血糖血脂、降低血壓等作用，因而深受人們喜愛[2-8]。大型真菌多糖作為免疫促進(jìn)劑藥物倍受關(guān)注，而香菇多糖是研究比較深入的多糖之一[9]。目前，在香菇子實體多糖方面研究較為全面，但對香菇菌糠多糖研究甚少。香菇菌糠是香菇采收后，其廢棄的培養(yǎng)料（即菌糠），其中殘留大量香菇菌絲體，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、微量元素及多糖等生物活性物質(zhì)，與子實體具有相似的生物活性和功能[10]。香菇作為大量栽培的食用菌，其菌糠量非常大，利用其菌糠提取多糖，不僅可在產(chǎn)業(yè)循環(huán)經(jīng)濟(jì)中提高附加值，延伸產(chǎn)業(yè)鏈，還可以消耗大量菌糠，減少污染，實現(xiàn)經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益的雙贏[11]。

本研究對香菇菌糠多糖提取工藝中提取溫度、時間、水料比等影響因子進(jìn)行綜合分析，最終獲得香菇菌糠中多糖提取工藝的最佳條件，為香菇菌糠中多糖的提取、制備和應(yīng)用研究提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1　試驗材料與方法

1.1試驗材料與試劑

香菇子實體采后的香菇菌糠，來源于中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所。

葡萄糖、蒽酮、濃硫酸等試劑皆為分析純。

1.2主要儀器

電子粉碎機(jī)、DU7400紫外分光光度計、恒溫水浴鍋、電子天平、高速臺式離心機(jī)。

1.3原料預(yù)處理

干燥的香菇菌糠粉碎，以備用。

1.4香菇菌糠多糖提取工藝流程

香菇菌糠烘干→粉碎→過篩 (70目)→稱重（0.1000 g）→浸提（在不同時間、溫度、水料比的條件下提?。?→離心（12 000 r·min-1） →取上清液→定容至30 mL→再移取上清液（500 μL） →蒽酮-硫酸試劑（5 mL）→搖勻水浴→冷卻→測吸光度。

1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

利用蒽酮法[12]的反應(yīng)原理，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定香菇菌糠多糖于波長620 nm處的吸光度，將測試結(jié)果以多糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線并求出回歸方程。

1.6菌糠多糖提取正交試驗設(shè)計

翻開課本或筆記，學(xué)生找到了正切函數(shù)的定義，設(shè)角α的終邊和單位圓交于點(x，y)，當(dāng)x≠0時，當(dāng)x=0時(α終邊在y軸上，90° 是其中的一個角)，tan α沒意義．

以溫度、時間、水料比這三個單因素試驗為基礎(chǔ)，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗的設(shè)計原理，應(yīng)用三因素三水平響應(yīng)面（response surface methodology，RSM）的分析方法[13-14]，確定影響工藝條件的因子，以多糖提取率作為響應(yīng)值繪制響應(yīng)面與等高線圖，分析和優(yōu)化最佳的提取條件。

1.7菌糠多糖提取方案和因素水平

采用Design Expert8.0軟件及中心組合試驗Box-Behnken設(shè)計方案，選取單因素（提取溫度、提取時間、水料比），對試驗最佳結(jié)果進(jìn)行綜合分析，試驗以提取溫度、提取時間、水料比為影響因素，以-1、0、1表示各因素的各水平值，采用響應(yīng)面分析方法作三因素三水平試驗分析，見表1。

表1　響應(yīng)面分析試驗因素及水平Tab.1　Factors and levels of response surface analysis in this test

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

通過處理的葡萄糖標(biāo)樣，以蒸餾水為空白對照,利用紫外分光光度度計在620 nm處測定溶液的吸光度，重復(fù)3次求平均值，結(jié)果見圖1。

圖1 葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard cure of glucose content determination

2.2單因素試驗結(jié)果

2.2.1提取溫度對香菇菌糠多糖提取率的影響

稱取0.1000 g的6份香菇菌糠，放置于10 mL試管中，分別加3 mL蒸餾水，搖勻水浴加熱，設(shè)置溫度梯度為50℃～100℃，以10℃為間隔，取6個值，提取4 h，冷卻后10 000 r·min-1離心10 min取上清液，30 mL去離子水定容，分別取0.5 mL溶液，再用蒸餾水稀釋1倍，搖勻后水?。?0℃）15 min，冷卻至常溫，測吸光度，取3次平均值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求含多糖量，試驗結(jié)果見圖2。

2.2.2提取時間對香菇菌糠多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取6份0.1000 g，各加入3 mL蒸餾水，于60℃下分別提取2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h，離心定容后測定其多糖的提取率（方法同2.2.1），結(jié)果見圖3。

圖2　提取溫度對香菇菌糠多糖提取率的影響Fig.2　Effect of temperature on the extraction rate of polysaccharide from waste materials of L.edodes

圖3　提取時間對香菇菌糠多糖提取率的影響Fig.3　Effect of extraction time on the extraction rate of polysaccharide from waste materials of L.edodes

由圖3可知，隨著時間的增加，香菇菌糠多糖的提取率隨之增高；當(dāng)時間到6 h時多糖菌糠提取率達(dá)最大值；隨后提取率開始呈下降趨勢。因此，6 h左右為最佳提取時間。

2.2.3水料比對香菇菌糠多糖提取率的影響

稱取0.1000 g的6份香菇菌糠，放置于10 mL試管中，分別加3 mL蒸餾水，搖勻水浴加熱，設(shè)置水料比為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL∶g） 6個等距梯度，分別按照順序加入分別加入1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL蒸餾水，60℃水浴加熱4 h后，離心定容后測定多糖的提取率（方法同2.2.1），結(jié)果如圖4所示。

由圖4表明，在試驗設(shè)定條件下，水料比增加，多糖提取率呈增加趨勢，水料比達(dá)60:1時多糖提取率最大。因此，水料比選擇60:1為佳。

2.3采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化香菇菌糠提取工藝

2.3.1響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果分析

香菇菌糠多糖提取工藝的響應(yīng)面試驗方案見表2。

圖4　水料比對香菇菌糠多糖提取率的影響Fig.4　Effect of water-material ratio on the extraction rate of polysaccharide from waste materials of L.edodes

表2　響應(yīng)面分析香菇菌糠多糖提取工藝設(shè)計及結(jié)果Tab.2　Response surface design and result analysis of polysaccharides from waste materials of L.edodes

2.3.2各因素間相互影響

通過3個因素相互影響分析作用，見圖5（A～F）。3個因素對響應(yīng)值的影響的大小為：X1提取時間＞X3水料比＞X2提取溫度。

2.3.3方程求解及最佳條件

用各個因素與響應(yīng)值作回歸擬合，所得回歸方程如下：

Y=0.055946+0.0007620X1+0.001257X2+0.0009183X3+ 0.0005045X1X3+0.001424X1X2-0.003051X2X3-0.002932X12-0.001342X22-0.002854X32

對回歸方程取一階偏導(dǎo)等于零并求解，確定最佳工藝因素的值，整理得如下：

圖5　各因素間的相互作用對香菇菌糠多糖提取率的影響Fig.5 Interaction between various factors on the extraction rate of polysaccharide from waste materials of L.edodes

解方程組得：X1=83.676℃、X2=5.619 h、X3= 55.152∶1（mL∶g）。為便于試驗實際操作，研究時將香菇菌糠多糖最佳的提取工藝參數(shù)條件進(jìn)行修正，確定提取溫度為84℃、提取時間6 h、水料比55∶1（mL∶g），以便于后續(xù)實際操作。

2.3.4響應(yīng)面理論值的驗證

采用軟件優(yōu)化得出香菇多糖提取的最佳理論工藝條件，但為了驗證香菇菌糠多提取率RSM優(yōu)化法最大理論值可靠性，研究開展了驗證試驗，驗證試驗綜合考慮試驗條件，實際情況選取提取溫度84℃、提取時間6 h、水料比55∶1（mL∶g），并進(jìn)行3次平行試驗，平均實際提取率5.61%，與理論預(yù)測提取率5.35%比較，誤差為3%，由此可見采用RSM優(yōu)化提取條件參數(shù)是準(zhǔn)確可靠的。

3　結(jié)論

采用蒽酮法對香菇菌糠多糖提取的工藝優(yōu)化條件為提取溫度84℃、提取時間6 h、水料比55.152∶1（mL∶g），試驗預(yù)測值為5.35，通過驗證結(jié)果（香菇多糖提取率5.61%。）表明，優(yōu)化出的香菇多糖配比工藝條件準(zhǔn)確、可靠，可為大量香菇菌糠多糖提取提供參考，減少菌糠浪費，實現(xiàn)菌糠循環(huán)再生利用。

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Optimization of Extraction Processing of Polysaccharide from Waste Materials of Lentinus edodes

ZHAO Chun-yan1,XIONG Yong2,GAO Guan-shi1,WU Su-rui1
(1.Kunming Edible Fungi Institute of All China Federation of Supply and Marketing Cooporatives,Kunming 650221,China; 2.Key Laboratory of Ethnic Medicine Resource Chemistry/State Ethnic Affairs Commission&Ministry of Education,Yunnan University of Nationalities,Kunming 650500,China)

To optimize the extraction processing of polysaccharide from waste materials of Lentinus edodes,single-factor experiment and response surface methodology(RSM)with three factors and three levels experiments according to the principles of Box-Behnken have been carried out.The results showed the highest extraction ratio(5.61%)of polysaccharide was obtained at 84℃,with extraction 6 h and water-material ratio of 55:1(mL·g-1).The optimization of extraction processing of polysaccharide could improve extraction rate of polysaccharide from lentinan.

Lentinus edodes;waste material;polysaccharide;esponse surface methodology(RSM)

S646.1A1003-8310（2015）05-0063-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.05.016

科技部國家科技支撐計劃項目（2012BAD36B02）；云南省科技創(chuàng)新人才計劃（2008OC008）。

趙春艷（1979-），女，碩士，助理研究員，主要從事食用菌遺傳資源研究。E-mail:99558737@qq.com

**通信作者：吳素蕊（1978-），女，碩士，副研究員，主要從事食用菌開發(fā)利用研究。E-mail:wusurui@163.com

2015-07-10