銀耳污染菌的分離鑒定及其抑菌活性物篩選*

陳 宏，賈 緯，聶毅磊，羅立津

（福建省微生物研究所福建省新藥（微生物）篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350007）

銀耳污染菌的分離鑒定及其抑菌活性物篩選*

陳 宏，賈 緯，聶毅磊，羅立津

（福建省微生物研究所福建省新藥（微生物）篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350007）

為控制銀耳（Tremella fuciformis）污染菌楊梅霜菌的危害，提供高效防治活性物質(zhì)。用平板分離純化獲得了楊梅霜菌菌株YC，鑒定其為鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）的種類。采用培養(yǎng)皿圓濾紙片法，測定12種活性物對菌株YC及銀耳伴生菌香灰菌（Hypoxylon sp.）生長的抑制作用，在12種活性物中，鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)物SM（福建省微生物研究所提供）對菌株YC的抑制作用較強(qiáng)，且對銀耳伴生菌香灰菌的生長基本無抑制作用，有望成為擴(kuò)大試驗(yàn)的供試物。

銀耳；鏈霉菌屬；活性物質(zhì)；篩選；抑制效果

在銀耳栽培過程中，常會遭遇到環(huán)境中致病微生物的污染，導(dǎo)致其減產(chǎn)，楊梅霜菌是引起銀耳栽培中一種常見病害的病原菌。肉眼觀察，楊梅霜菌呈白色小顆粒狀，很像楊梅干、柿丸干上霜后的形態(tài)。因該病害的癥狀與楊梅霜相似，所以取名為“楊梅霜菌”[1]。據(jù)報(bào)道，楊梅霜菌是放線菌類，主要為鏈霉菌屬、游動放線菌屬和諾卡氏菌屬的種類[2]；也有研究認(rèn)為它是一種半知菌[3]。通常楊梅霜菌在銀耳母種和原種前、中期是很難發(fā)現(xiàn)的，往往只有嚴(yán)重感染后才能被發(fā)現(xiàn)。目前還沒有特別有效、針對性強(qiáng)的防治方法，主要還是通過在生產(chǎn)中改善培養(yǎng)環(huán)境條件來進(jìn)行預(yù)防性控制。為此，我們從四州簡陽被污染的銀耳瓶中分離得到楊梅霜菌，對其進(jìn)行了菌種鑒定。為控制其危害，提供高效防治藥劑，篩選12種活性物質(zhì)，通過測定對該病菌的抑菌圈大小，確認(rèn)供試物質(zhì)的抑菌能力，并依據(jù)其對銀耳伴生菌是否有抑制性，篩選出可供進(jìn)一步實(shí)際應(yīng)用的有效活性物質(zhì)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。

銀耳固體培養(yǎng)基：木屑70%、麥麩28%、石膏粉2%，均勻拌料，按1∶1.25加水混合。

1.1.2樣品

污染了楊梅霜菌的銀耳栽培種瓶，由四川簡陽某食用菌基地提供。

1.1.3菌株

香灰菌株（Hypoxylon sp.），由四川簡陽某食用菌基地提供。

1.1.4供試活性物質(zhì)及提供商

四霉素，遼寧微科生物工程有限公司；武夷霉素，福建省微生物研究所；寧南霉素，德強(qiáng)生物股份有限公司；CL、SM、ZS三者均為鏈霉菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物，由福建省微生物研究所提供；井岡霉素，武漢科諾生物科技股份有限公司；百菌清，江蘇利民化工股份有限公司；甲基托布津，江功龍燈化學(xué)有限公司；多菌靈，四川國光農(nóng)化股份有限公司；氟嗎霜，旭日化工（山東）有限公司；惡霉靈，四川國光農(nóng)化股份有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1楊梅霜菌的分離純化

從銀耳染菌瓶中取少量基質(zhì)，置于無菌水中，用玻璃珠打散，吸原液及稀釋液0.1 mL在PDA平板上涂布，平板28℃培養(yǎng)1周。觀察菌落形態(tài)和顯微形態(tài)，將單菌落挑至PDA斜面培養(yǎng)。

1.2.2菌種鑒別

（1）形態(tài)培養(yǎng)特征

單分離菌株的斜面培養(yǎng)物劃線于PDA平板，斜插蓋玻片，28℃培養(yǎng)4 d～6 d，觀察氣生菌絲、基內(nèi)菌絲及色素變化情況。培養(yǎng)特征和生理生化特性試驗(yàn)采用《鏈霉菌鑒定手冊》[4]中推薦的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)、觀察和描述。

（2） 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增及基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株基因組DNA采用酶解法提取，得到的DNA樣品-20℃貯存。其可作為DNA模板進(jìn)行16S rRNA基因PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司測序。將所測菌株的16S rRNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有序列比對，進(jìn)行同源性分析鑒定。

1.2.3抑菌活性物質(zhì)篩選

用培養(yǎng)皿圓濾紙片法對供試的12種活性物質(zhì)進(jìn)行抑菌圈測定。將PDA培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，制成厚5 mm的平板培養(yǎng)基，凝固后，將培養(yǎng)24 h的楊梅霜菌，用無菌水制備菌懸液，涂布到平板表面；待菌液干后，將藥敏紙片（直徑為5 mm，厚約1 mm）置入培養(yǎng)皿，每皿4片，28℃培養(yǎng)48 h，測定抑菌圈直徑。

香灰菌（Hypoxylon sp.）是一種半知菌，對銀耳的栽培出耳至關(guān)重要，被稱為銀耳的“伴生菌”[5-6]。楊梅霜菌最喜寄生于香灰菌菌絲體中[7]。銀耳在PDA平板培養(yǎng)基上生長十分緩慢，故選用銀耳的伴生菌香灰菌，來考察所選活性物質(zhì)對其是否有抑制作用。上述實(shí)驗(yàn)中抑菌圈較大的活性物質(zhì)，再進(jìn)行銀耳的伴生菌香灰菌的抑菌試驗(yàn)。最終選取既能抑制楊梅霜菌生長，又較少抑制香灰菌生長的活性物質(zhì)。

1.2.4活性物SM、ZS、CL在高溫滅菌后對楊梅霜菌菌株YC的抑制能力

由于銀耳培養(yǎng)時培養(yǎng)基需要高溫滅菌，如果所篩選的藥物能和培養(yǎng)基一起滅菌又不失活性，則有利于將來的擴(kuò)大應(yīng)用。將所篩選的藥物加入到PDA培養(yǎng)基中，與培養(yǎng)基一起滅菌后接入楊梅霜菌菌株YC，培養(yǎng)7 d，觀察藥物對該菌的抑制作用。

2　結(jié)果與分析

2.1菌種分離和鑒別

在PDA平板上分離純化后得到菌落形態(tài)一致的楊梅霜菌株，在PDA培養(yǎng)基上菌落呈白色，圓形微凸?fàn)?，質(zhì)地較致密堅(jiān)硬，具有放線菌菌落的特征，菌落背面產(chǎn)生橙紅色色素，見圖1。

選取其中1株編號為YC的菌株，回接到已接入銀耳菌株的銀耳固體培養(yǎng)基中，在25℃下培養(yǎng)，約1周內(nèi)出現(xiàn)與四川簡陽某食用菌基地提供的污染了楊梅霜菌的銀耳栽培種瓶相同的染病癥狀，說明菌株YC是污染菌。

將菌株YC進(jìn)行菌種鑒定，提取菌株總DNA，進(jìn)行16S rRNA序列擴(kuò)增，并進(jìn)行序列測定，用BLAST軟件與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫的16S rRNA進(jìn)行比對，結(jié)果表明，其大小為1 386 bp，與Streptomyces sp.Js-1（2011） 的同源性最高，相似性達(dá)99%（圖2）。說明該菌株YC屬于鏈霉菌屬。

圖1　疑似楊梅霜菌菌株YC的菌落形態(tài)Fig.1　Colonial morphology of strain YC

圖2　菌株YC和相關(guān)序列菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2　The phylogenetic tree formed by strain YC and 3 strains of Streptomyces sp.

該菌株能利用葡萄糖、果糖、乳糖、鼠李糖、甘油、酒石酸甲鈉、檸檬酸鈉、乙酸鈉、阿拉伯糖，不能利用蔗糖、麥芽糖、甘露醇、半乳糖、棉籽糖、木糖、琥珀酸鈉、草酸鈉、肌醇，不能水解纖維素。能液化明膠，胨化牛奶，并使石蕊牛奶還原褪色，不產(chǎn)生硫化氫。

2.2供試活性物質(zhì)對楊梅霜菌菌株YC的抑菌效果

應(yīng)用培養(yǎng)皿圓濾紙片法測定12種供試活性物質(zhì)對菌株YC的抑菌能力，結(jié)果如表l所示。

從表1可以看出，四霉素、百菌清、氟嗎霜、鏈霉菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物（CL、SM、ZS）中共6種能形成抑菌圈，抑菌圈的直徑大小依次為四霉素＞SM＞氟嗎霜/ZS＞百菌清＞CL。

2.3供試活性物質(zhì)對銀耳伴生菌香灰菌的抑制作用

銀耳在PDA平板培養(yǎng)基上生長十分緩慢，故選用銀耳的伴生菌香灰菌，來考察所選活性物質(zhì)對其是否有抑制作用。由于百菌清的抑菌圈不透明，故棄去不選。選取四霉素、SM、氟嗎霜、ZS、CL進(jìn)行香灰菌生長抑制試驗(yàn)，其結(jié)果見表2。

表1　供試活性物質(zhì)對菌株YC抑菌圈直徑的影響Tab.1　Effect of active material on diameter of suppressed germ circle of the strain YC

表2　供試活性物對銀耳伴生菌香灰菌的抑制作用Tab.2　Inhibitory effects of the active materials on Hypoxylon sp.

表2的結(jié)果表明，鏈霉菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物SM、ZS、CL，有望成為擴(kuò)大試驗(yàn)的供試藥物。

2.4活性物質(zhì)SM、ZS、CL在高溫滅菌后對楊梅霜菌菌株YC的抑制能力

將所篩選的活性物質(zhì)加入到PDA培養(yǎng)基中，與培養(yǎng)基一起滅菌后接入楊梅霜菌菌株YC，結(jié)果見表3。

經(jīng)培養(yǎng)、觀察后發(fā)現(xiàn)，SM在濃度25 μg·L-1以上時仍有抑菌能力，但CL、ZS在濃度50 μg·L-1時仍無法抑制菌株YC的生長，說明可能高溫滅菌破壞了其殺菌能力。

3　結(jié)論

食用菌生長過程被認(rèn)為是食用菌同雜菌作斗爭的過程，所以食用菌栽培成敗的關(guān)鍵取決于抗雜菌水平的高低。目前，生產(chǎn)上仍采用藥物防治來抑制雜菌生長，因此，篩選能有效抑制雜菌繁殖，又不影響食用菌生長的藥物具有重要意義。鏈霉菌發(fā)酵代謝活性物質(zhì)SM，既能抑制楊梅霜菌生長，又基本不抑制銀耳伴生菌的生長，且耐高溫滅菌，有望成為擴(kuò)大試驗(yàn)的供試藥物。

表3　SM、ZS、CL高溫滅菌后對楊梅霜菌YC的抑制能力Tab.3　Inhibitory effects of SM,ZS and CL on the strain YC after high temperature setrilization

[1]陳初旭.袋栽銀耳兩大病害發(fā)生原因初探[J].中國食用菌，1996，15（6）：37-38.

[2]張海風(fēng).銀耳菌袋中主要污染菌的分離鑒定及微生物的TRFLP分析[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2011.

[3]黃年來.中國銀耳生產(chǎn)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000.

[4]中國科學(xué)院微生物研究所放線菌分類組.鏈霉菌鑒定手冊[M].北京：科學(xué)出版社，1975.

[5]梁勤.我國銀耳種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及木質(zhì)素、纖維素酶活測定[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[6]汪國蓮，陳立國，陳明.銀耳菌絲生長營養(yǎng)條件的初步研究[J].中國食用菌，2001，20（4）：12-14.

[7]戴維浩，戴偉鴻.銀耳楊梅霜菌的污染現(xiàn)象和防治方法[J].浙江食用菌，2010，18（2）：48.

Isolation and Identification of the Contaminative Microorganism from Tremella fuciformis Fungus and Inhibitory Effects of Active Materials on Streptomyces sp.

CHEN Hong,JIA Wei,NIE Yi-lei,LUO Li-jin
(Fujian Institute of Microbiology,Fujian Provincial Key Laboratory of Screening for Novel Microbial Products,Fuzhou 350007, China)

In order to screening the effective materials to inhibit the contaminative microorganism from Tremella fuciformis fungus,the contaminative microorganism named Yangmeishuang,was isolated by plate isolation method.The strain was named YC, which belonged to the genus Streptomyces.The inhibitory effects of 12 active materials on the strain YC were determined by using filter paper method,and the inhibitory effects of the selected effective materials on Hypoxylon sp.which is the cohabitant fungus of T.fuciformis were examined.The effective material SM produced by Streptomyces(provided by Fujian Institute of Microbiology)had more powerful inhibitory effect on strain YC and little inhibitory effect on Hypoxylon sp..It meaned that the effective material SM could be used to control the contaminative microorganism from T.fuciformis fungus.

Tremella fuciformis;Streptomyces;active material;screening;inhibitory effect

S646.9A1003-8310（2015）05-0060-04

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.05.015

福州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013-G-97）。

陳宏（1966-），女，碩士，高級工程師，主要從事環(huán)境微生物領(lǐng)域的研究。E-mail:peaceful88@163.com

2015-07-04