miR-335在急性缺血性腦卒中表達(dá)下調(diào)及對(duì)鈣調(diào)蛋白的調(diào)控作用

，，海軍，

(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診科)

·臨床醫(yī)學(xué)·

miR-335在急性缺血性腦卒中表達(dá)下調(diào)及對(duì)鈣調(diào)蛋白的調(diào)控作用

袁梅1，湯永紅1，袁海軍2*，周成芳1

(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診科)

目的檢測(cè)微小RNA-335在急性缺血性腦卒中(AIS)患者血清中的表達(dá)，并探討其對(duì)鈣調(diào)蛋白(CaM)調(diào)控的作用機(jī)制。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)法測(cè)定106例AIS患者及98例健康對(duì)照組血清中miR-335表達(dá)情況；用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢分析miR-335對(duì)鈣調(diào)蛋白編碼基因CALM1的靶向結(jié)合關(guān)系；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-335模擬物、抑制物以及相應(yīng)陰性對(duì)照物分別轉(zhuǎn)染至人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中并進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和Western blot分別檢測(cè)干預(yù)后HUVECs中鈣調(diào)蛋白mRNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果與健康對(duì)照組相比較，AIS組患者血清miR-335表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)；生物信息學(xué)軟件的查詢分析顯示CALM1存在miR-335潛在靶向結(jié)合位點(diǎn)；RT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示miR-335模擬物組CaM mRNA和蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著下降(P<0.01)，而miR-335抑制物組CaM mRNA和蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著增高(均P<0.05)。結(jié)論急性缺血性腦卒中患者血清miR-335表達(dá)明顯下降，表達(dá)下調(diào)的miR-335可能通過(guò)上調(diào)鈣調(diào)蛋白的表達(dá)從而發(fā)揮重要作用。

微小RNA-335； 鈣調(diào)蛋白； 急性缺血性腦卒中

鈣超載是腦缺血/缺血再灌注損傷的重要啟動(dòng)因素，是導(dǎo)致急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke,AIS)患者腦組織損害和神經(jīng)功能障礙的病理生理過(guò)程，最終可導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。而鈣離子生理功能的發(fā)揮主要是由鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)來(lái)調(diào)節(jié)。以往研究發(fā)現(xiàn)腦缺血/缺血再灌注后，鈣調(diào)蛋白表達(dá)量明顯升高[1-2]。近年來(lái)，研究表明微小RNA(microRNA,miRNA)調(diào)控是基因在轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的非常重要的調(diào)控機(jī)制，參與了細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生命過(guò)程的調(diào)控，并與腦卒中密切相關(guān)[3]。這提示是否存在特定的miRNA調(diào)控CaM表達(dá)參與腦卒中后的病理生理過(guò)程。研究顯示miR-335在腦缺血再灌注動(dòng)物模型腦組織中表達(dá)有下調(diào)[4]。同時(shí)通過(guò)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)蛋白編碼基因(CALM1)3′UTR區(qū)存在miR-335潛在的靶向結(jié)合序列，但目前缺少文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究旨在檢測(cè)miR-335在急性缺血性腦卒中患者血清中的表達(dá)水平并探討miR-335是否靶向調(diào)控鈣調(diào)蛋白的表達(dá)。

1 資料與方法

1.1一般資料連續(xù)收集2013年6月～12月本院神經(jīng)內(nèi)科和急診科就診的發(fā)病14天內(nèi)(≤14天)的急性缺血性腦卒中患者共106例，其中男60例，女46例，年齡67.6±6.2歲；對(duì)照組來(lái)自同期本院體檢中心健康普查的健康隨機(jī)個(gè)體，共98例，男56例，女42例，年齡65.9±6.8歲，兩組在性別、年齡上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。缺血性腦卒中診斷和排除標(biāo)準(zhǔn)參考前期研究報(bào)道[3]。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象或家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2材料與試劑人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)購(gòu)自于中南大學(xué)湘雅醫(yī)院中心試驗(yàn)室，Trizol RNA抽提試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Rever Tra Ace?(日本TOYOBO公司)，染料法實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTM(大連TAKARA公司)，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，Lipofectamin 2000(美國(guó)Invitrogen公司)，多克隆兔抗人鈣調(diào)蛋白抗體和山羊抗兔IgG-HRP抗體(美國(guó)ABclonal公司)，miR-335模擬物、抑制物購(gòu)自上海吉瑪生物工程公司，逆轉(zhuǎn)錄頸環(huán)引物以及PCR擴(kuò)增引物由上海生工生物有限公司合成。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)所有受測(cè)者均抽取靜脈血5 mL，常溫下3 000 r/min離心10 min，收集上層血清1 mL，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎肨rizol法提取血清中總RNA，并用分光光度計(jì)檢測(cè)所提取RNA的質(zhì)量。采用qRT-PCR法檢測(cè)各標(biāo)本miR-335濃度。逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增均嚴(yán)格按照相應(yīng)說(shuō)明書進(jìn)行操作。以cel-miR-39為內(nèi)。miR-335頸環(huán)引物5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TCG CAC TGG ATA CGA CAC ATT T-3′，上游引物5′-CTC CAG CTG TCA AGA GCA ATA AC G AA-3′，下游引物5′- TCC AGT GCA GGG TCC GAG GT-3。cel-miR-39頸環(huán)引物5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA AAG C -3′，上游引物5′-CAC TCC GTC ACC GGG TGT AAA TC-3′，下游引物5′- TCC AGT GCA GGG TCC GAG GT-3。PCR反應(yīng)條件：95℃ 預(yù)變性2 min;95℃ 變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-△△CT法計(jì)算各組miR-335的相對(duì)表達(dá)量。

1.4生物學(xué)軟件靶基因預(yù)測(cè)通過(guò)TargetScan和Miranda兩種生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢來(lái)預(yù)測(cè)miR-335與鈣調(diào)蛋白編碼基因CALM1的靶向結(jié)合位點(diǎn)。

1.5細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染HUVECs細(xì)胞接種于6孔板中，加入含10%FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，在37 ℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),約80%～90%融合時(shí)，采用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000方法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分5組：①模擬物干預(yù)組(miR-335-mimic組)：加入has-miR-335 mimics；②模擬物陰性對(duì)照組(NC組)：加入陰性對(duì)照；③抑制物干預(yù)組(miR-335-inhibitor組)：加入has-miR-335-inhibitors；④抑制物陰性對(duì)照組(NC inhibitor組)：加入NC inhibitor；⑤ 空白對(duì)照組(blank組)：不加干預(yù)物。嚴(yán)格按照脂質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，6 h內(nèi)用OMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，之后改用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h收取細(xì)胞沉淀，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 RT-PCR檢測(cè)用Trlzol法分離各組轉(zhuǎn)染培養(yǎng)后的HUEVC中總RNA，并用分光光度計(jì)檢測(cè)所提取RNA的質(zhì)量。采用RT-PCR法檢各組干預(yù)后鈣調(diào)蛋白mRNA的表達(dá)水平。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及PCR均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。用β-actin作為內(nèi)參。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)。每組樣本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。PCR擴(kuò)增引物見表1。

1.7 Western blot檢測(cè)蛋白提取和測(cè)定采用RIPA裂解液/BCA蛋白定量試劑盒。

表1鈣調(diào)蛋白基因RT-PCR引物

引物序列(5'-3')擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度CaLM1-F5'-TGAAGTGGATGCTGATGGTAATGG-3'CaLM1-R5'-CATAGTTGACTTGTCCGTCTCCAT-3'257bpβ-actin-F5'-CACTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3'β-actin-R5'-ACTCGTCATACTCCTGCTTGCT-3'315bp

配制12%分離膠、5%濃縮膠，加入約15 μg蛋白樣品，多余空用2×SDS上樣緩沖液補(bǔ)齊，然后進(jìn)行電泳，電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，冰上轉(zhuǎn)膜1.5 h，室溫封閉2 h，加入1∶5 000稀釋的鈣調(diào)蛋白抗體4℃輕搖過(guò)夜，再加1∶10 000稀釋的二抗室溫孵育2 h，用PBST將膜清洗3次后采用ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色曝光。β-actin作為內(nèi)參。用Amersham圖像分析系統(tǒng)對(duì)Western blot目的條帶進(jìn)行光密度掃描，然后用Quantity One軟件進(jìn)行灰度值分析,待測(cè)蛋白的灰度值/內(nèi)參灰度值代表目的蛋白的表達(dá)量。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1兩組miR-335表達(dá)的比較血清miR-335在病例組(0.35±0.26)表達(dá)明顯低于對(duì)照組(1.21±0.32)(P<0.01)。

2.2生物學(xué)軟件靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果通過(guò)TargetScan和Miranda生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢分析發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)蛋白編碼基因CALM1存在miR-335靶向結(jié)合位點(diǎn)，見圖1。

圖1 生物學(xué)軟件靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果 通過(guò)生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)查詢發(fā)現(xiàn)miR-335與CALM1存在靶向結(jié)合位點(diǎn)

2.3 miR-335對(duì)CALM1 mRNA表達(dá)的影響空白對(duì)照組、模擬物陰性對(duì)照組、抑制物陰性對(duì)照組3組CALM1 mRNA 表達(dá)差異無(wú)顯著性 (P>0.05)；轉(zhuǎn)染miR-335模擬物后，HUVECs 表達(dá)mRNA的量明顯低于空白對(duì)照和模擬物陰性對(duì)照組(P<0.01)；而轉(zhuǎn)染miR-335抑制物后，HUVECs 表達(dá)CALM1 mRNA的量明顯高于空白對(duì)照和抑制物陰性對(duì)照組(P<0.05)，見圖2。這表明miR-335影響CALM1 mRNA穩(wěn)定性。

2.4 miR-335對(duì)CaM蛋白表達(dá)的影響轉(zhuǎn)染miR-335模擬物后，HUVECs 表達(dá)CaM蛋白的量明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.01)；而轉(zhuǎn)染miR-335抑制物后，HUVECs 表達(dá)CaM蛋白的量明顯高于空白對(duì)照組和抑制物陰性對(duì)照組(P<0.01)，見圖3。這表明miR-335能顯著抑制CALM1mRNA翻譯影響蛋白的表達(dá)水平。

3 討 論

本研究通過(guò)病例-對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)急性缺血性腦卒中患者血清miR-335表達(dá)水平明顯下降，結(jié)合前期研究及生物學(xué)信息軟件分析，發(fā)現(xiàn)miR-335與鈣調(diào)蛋白的潛在調(diào)控關(guān)系，并進(jìn)一步通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這種調(diào)控關(guān)系。

圖2 不同干預(yù)組CALM1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量 A：CALM1 mRNA PCR跑膠條帶，M：Marker；1：空白對(duì)照組；2：miR-335模擬物組；3：miR-335抑制物組；4：模擬物陰性對(duì)照組；5：抑制物陰性對(duì)照組.B：為相應(yīng)內(nèi)參β-actin PCR跑膠條帶.C：相應(yīng)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖.與空白對(duì)照組和模擬物陰性對(duì)照組相比較，*:P<0.01；與空白對(duì)照組和抑制物陰性對(duì)照組相比較，#:P<0.05

微小RNA(microRNA,miRNA)是一類內(nèi)源性的19～25個(gè)核苷酸大小的非編碼RNA分子，包含特定堿基序列，稱為“種子序列”，能通過(guò)堿基互補(bǔ)匹配原則識(shí)別結(jié)合靶基因mRNA的3′UTR特異性序列，抑制靶mRNA的翻譯或?qū)е缕浣到猓谵D(zhuǎn)錄后水平沉默靶基因，對(duì)基因表達(dá)起著重要的調(diào)控作用。miRNA參與了細(xì)胞的代謝、增殖、分化和凋亡及個(gè)體發(fā)育等生命過(guò)程的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與了神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)、發(fā)育、生理功能和疾病過(guò)程，也參與了動(dòng)脈斑塊不穩(wěn)定性、內(nèi)皮功能障礙、腦水腫、炎癥、細(xì)胞凋亡等腦卒中中間環(huán)節(jié)的調(diào)控，與腦卒中有密切相關(guān)性[5-7]。識(shí)別和鑒定與腦卒中相關(guān)的miRNA，并明確其作用及調(diào)控機(jī)理，并把他們整合到基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中是當(dāng)前表觀遺傳醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，也是腦卒中防治的熱點(diǎn)。腦卒中患者治療預(yù)后不佳，是臨床工作長(zhǎng)期的難題。研究miRNA從RNA干擾這一表觀遺傳學(xué)角度認(rèn)識(shí)腦卒中后腦損害，為尋找AIS患者腦保護(hù)治療的新靶點(diǎn)、研發(fā)新的藥物治療有著重要的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。Samaraweera等[8]研究發(fā)現(xiàn)miR-335能下調(diào)HAND1和JAG1的表達(dá)水平，阻斷神經(jīng)元的生長(zhǎng)、分化，參與對(duì)神經(jīng)元發(fā)育的調(diào)節(jié)，Tomé等[9]研究發(fā)現(xiàn)過(guò)度表達(dá)的miR-335能夠下調(diào)與細(xì)胞增殖、分化和凋亡相關(guān)的AP-1的表達(dá)，而Shu等[10]的研究發(fā)現(xiàn)使用mir-335拮抗劑(antagomir-335)后，下調(diào)miR-335可以使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)停滯、細(xì)胞凋亡，以往這些研究提示miR-335可能是神經(jīng)元重要調(diào)控因子，異常表達(dá)的miR-335可能與神經(jīng)系統(tǒng)疾病有密切相關(guān)性。更重要的是，最近有研究顯示miR-335在腦缺血再灌注動(dòng)物模型腦組織中表達(dá)有下調(diào)[4]，本研究通過(guò)大樣本的病例-對(duì)照研究，也發(fā)現(xiàn)急性缺血性腦卒中患者血清miR-335水平明顯下調(diào)，與健康對(duì)照組相比較有顯著性差異(P<0.01)。miRNA能夠自由通過(guò)血腦屏障[11]，可見異常表達(dá)的miR-335可能在急性缺血性腦卒中病理生理過(guò)程中起重要作用，在進(jìn)一步研究中，我們探討了miR-335影響AIS的可能機(jī)制。

大量研究表明鈣超載在腦缺血損傷的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用，而鈣離子生理功能的發(fā)揮主要是由鈣調(diào)蛋白來(lái)介導(dǎo)調(diào)節(jié)。以往有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注后，隨著神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的鈣超載，大鼠腦組織的CaM活性與含量也明顯升高，再灌注后其升高較腦缺血后更為顯著[1]，而前期研究也發(fā)現(xiàn)急性缺血性腦卒中患者血清鈣調(diào)蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，且與神經(jīng)功能缺損程度呈正相關(guān)[2]。通過(guò)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢分析發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)蛋白編碼基因CALM1 3′UTR存在序列(GCUCUUG)與miR-335的“種子序列”堿基互補(bǔ)配對(duì)(見圖1)，因而推測(cè)miR-335與鈣調(diào)蛋白之間可能存在負(fù)向調(diào)控關(guān)系。本研究通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-335模擬物和抑制物轉(zhuǎn)染至HUVECs中并進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，采用RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)干預(yù)后HUVECs細(xì)胞中鈣調(diào)蛋白mRNA和蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-335可在mRNA和蛋白水平負(fù)向調(diào)控CaM的表達(dá)，從而推測(cè)在急性缺血性腦卒中患者腦細(xì)胞損害和神經(jīng)功能障礙機(jī)制中存在miR-335對(duì)鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)，下調(diào)的miR-335對(duì)鈣調(diào)蛋白基因表達(dá)抑制不足，導(dǎo)致腦組織鈣調(diào)蛋白過(guò)表達(dá)。

總之，本研究表明，在急性缺血性腦卒中下調(diào)的miR-335促進(jìn)了鈣調(diào)蛋白表達(dá)上調(diào)，參與急性缺血性腦卒中鈣超載損害過(guò)程。本研究為開展針對(duì)急性缺血性腦卒中患者miR-335靶向治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

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NegativeRegulationofCalmodulinbymiR-335inAcuteIschemicStroke

YUAN Mei,TANG Yonghong,YUAN Haijun,et al

(DepartmentofNeurology,theSecondAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveThe miRNA dysfunction is suspected to be a contributing factor for many CNS pathologies including ischemic stroke.The present study investigates the expression of serum miR-335 in acute ischemic stroke (AIS),and explores the underlying mechanisms of miR-335 in acute ischemic stroke (AIS).MethodsBlood samples were obtained from AIS patients (n=106) and healthy controls (n= 98).MiR-335 was measured by using a quantitative real-time PCR.Bioinformatics database assay was used to determine whether calmodulin gene (CALM1) was the direct target of miR-335.The miR-335 mimics and inhibitors were transfected into human umbilical vein epithelial cells (HUVECs) with lipofectamine respectively.Calmodulin expression was determined by Western blot and reverse transcription-PCR (RT-PCR) in the cultured HUVECs.ResultsCompared with the healthy control group,the expression of serum miR-335 was significantly lower in patients with AIS group (P<0.01).In addition,bioinformatics database assay show that the CALM1 present the binding sites,which was potentially targeted by miR-335.Finally，Transfection of the miR-335 mimic inhibited the expression of CaM mRNA and protein in the HUVEC compared to the control group (P<0.01),while transfection of the miR-335 inhibitors increased the expression of CaM mRNA and protein (P<0.05).ConclusionMiR-335 down-regulation may increase the ischemic brain injury through up-regulating the expression of CaM.

microRNA-335; calmodulin; acute ischemic stroke

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.03.010

2014-10-20；

2015-03-15

衡陽(yáng)市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014KJ40).

*通訊作者，E-mail：yuanhaijun211@163.com.

R743.3

A

(此文編輯：朱雯霞)