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    HSP90α/β蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義

    2015-12-26 07:08:34,,,,,,
    關(guān)鍵詞:胃癌

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    (1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所;腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 衡陽 421001; 2.郴州市第一人民醫(yī)院中心醫(yī)院消化內(nèi)科;3.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻喉科; 4.邵陽醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校附屬醫(yī)院病理科;5.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院疼痛科)

    HSP90α/β蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義

    雷艷1,2,張志偉1*,劉重元1,肖娟3,張先鋒3,伍石華4,周華茂5

    (1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所;腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 衡陽 421001; 2.郴州市第一人民醫(yī)院中心醫(yī)院消化內(nèi)科;3.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻喉科; 4.邵陽醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校附屬醫(yī)院病理科;5.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院疼痛科)

    目的觀察熱休克蛋白90α/β(heat shock protein 90α/β,HSP90α/β)在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義,為胃癌的早期診斷與分子病理分型提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)資料。方法采用免疫組織化學(xué)染色結(jié)合組織芯片,觀察HSP90α/β蛋白質(zhì)在正常胃黏膜組織、癌旁組織及胃癌組織中的表達(dá);然后分析HSP90α/β蛋白質(zhì)在胃癌組織中表達(dá)的臨床意義。結(jié)果免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,胃癌組織中HSP90α/β蛋白質(zhì)表達(dá)的陽性率高于正常胃黏膜組織和癌旁組織(P<0.05);癌旁組織中表達(dá)的陽性率高于正常胃黏膜組織(P<0.05);淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者組織中表達(dá)的陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05);Ⅲ~Ⅳ期患者組織中表達(dá)的陽性率高于Ⅰ~Ⅱ期(P<0.05)。結(jié)論HSP90α/β蛋白質(zhì)的表達(dá)與胃癌組織的發(fā)生、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān),即隨著胃癌組織分化程度的降低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生及TNM分期的增加而表達(dá)升高。

    胃癌; HSP90α/β蛋白質(zhì); 臨床意義

    胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤,其發(fā)病率居消化道腫瘤第一位[1]。內(nèi)鏡檢查及活檢是目前胃癌診斷的主要方法之一,但因早期胃癌臨床癥狀不典型,許多患者就診時(shí)已為胃癌晚期,致使患者臨床預(yù)后差,因此早期診斷仍是防治胃癌的關(guān)鍵。至今,一些胃癌相關(guān)的蛋白質(zhì)分子被不斷的揭示,如CEA、CA19-9和CA72-4等,為早期胃癌的診斷提供了可能[2]。本課題組前期應(yīng)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選獲得了238個(gè)胃癌相關(guān)差異表達(dá)蛋白質(zhì)[3-4],從中選取差異倍數(shù)大的胃癌相關(guān)蛋白HSP90α/β進(jìn)行檢測(cè)與分析,為胃癌的早期診斷提供實(shí)驗(yàn)資料。

    1 材料與方法

    1.1病例資料組織芯片(包括正常胃黏膜組織、癌旁組織及胃癌組織)由湘潭市第一人民醫(yī)院病理科贈(zèng)送。該組織芯片包括自2003年~2009年湘潭市第一人民醫(yī)院胃癌患者手術(shù)切除標(biāo)本81例,其中女性25例,男性56例,患者平均年齡為55歲(27~81歲);49例胃癌腫塊>3.0 cm,32例≤3.0 cm;胃癌組織包括胃高分化腺癌5例、中分化腺癌17例、低分化腺癌59例;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者26例、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者55例;根據(jù)WHO的TNM分期,Ⅰ~Ⅱ期32例,Ⅲ~Ⅳ期49例。組織芯片中正常胃黏膜組織對(duì)照為34例胃癌患者距癌灶10 cm以上胃黏膜組織。胃癌組織芯片包括5×10個(gè)點(diǎn)陣,芯片中最底一排的右側(cè)最后一孔為空白標(biāo)記孔,以確定組織排列的方向。上述所有組織均經(jīng)病理確診,所有患者術(shù)前均未進(jìn)行化、放療。

    1.2主要試劑抗HSP90α/β蛋白抗體購自美國Santa Cruz公司;DAB顯色試劑盒和S-P免疫組織化學(xué)染色試劑盒購自福建邁新生物技術(shù)有限公司。

    1.3免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)采用免疫組織化學(xué)染色法(S-P法)觀察HSP90α/β蛋白質(zhì)在正常胃黏膜組織、癌旁組織和胃癌組織中的表達(dá),實(shí)驗(yàn)設(shè)立陽性對(duì)照(由福建邁新生物有限公司提供)和陰性對(duì)照(PBS替代一抗體),步驟如下:(1)將組織芯片置于二甲苯中充分脫蠟,不同濃度的酒精水化。(2)將組織芯片置于0.01 mol/L枸椽酸鹽緩沖液(pH6.0)中92~98 ℃ 5 min。(3)滴加3%過氧化物酶37 ℃ 15 min。(4)滴加非免疫的動(dòng)物血清封閉37 ℃ 10 min。(5)滴加一抗(1∶1 000)4 ℃過夜。(6)滴加二抗(1∶2 000)37 ℃ 15 min。(7)滴加鏈霉菌抗生物素蛋白—過氧化物酶溶液37 ℃ 15 min。(8)DAB顯色后,復(fù)染、透明、封片,顯微鏡下觀察與蛋白質(zhì)在不同組織中的表達(dá)情況。

    1.4不同組織中HSP90α/β蛋白質(zhì)表達(dá)結(jié)果的判定顯微鏡下觀察HSP90α/β蛋白質(zhì)的表達(dá)部位與染色情況,蛋白質(zhì)陽性表達(dá)顯示強(qiáng)度分為黃色、棕褐色。隨機(jī)選取組織芯片中每例組織的5個(gè)不同高倍鏡視野,記數(shù)每個(gè)視野中總細(xì)胞數(shù)與蛋白質(zhì)陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù),重復(fù)計(jì)數(shù)3次,取平均值作為細(xì)胞數(shù),計(jì)算不同組織中HSP90α/β蛋白質(zhì)的陽性表達(dá)率。不同組織中HSP90α/β蛋白質(zhì)表達(dá)結(jié)果的判定,根據(jù)顯色的強(qiáng)度與組織中細(xì)胞的陽性表達(dá)率綜合計(jì)分。顯色強(qiáng)度計(jì)分為:無顯色為1分,黃色為2分,棕褐色為3分;細(xì)胞陽性表達(dá)率計(jì)分為:≤10%為1分;11%~50%為2分;≥50%為3分。將顯色強(qiáng)度分值×細(xì)胞陽性表達(dá)率分值所得數(shù)據(jù),其中1分為陰性“-”;2~5分為陽性“+”,≥6分為強(qiáng)陽性“+++”,另外細(xì)胞陽性表達(dá)率>l0%者也為蛋白質(zhì)表達(dá)陽性。

    1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用χ2檢驗(yàn)和方差分析蛋白質(zhì)表達(dá)與臨床資料的關(guān)系,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1免疫組織化學(xué)染色觀察HSP90α/β蛋白質(zhì)的表達(dá)采用免疫組織化學(xué)染色觀察組織芯片中HSP90α/β蛋白質(zhì)在正常胃黏膜組織、癌旁組織及胃癌組織中的表達(dá),結(jié)果顯示HSP90α/β蛋白質(zhì)主要在細(xì)胞漿中表達(dá)(圖1)。

    2.2 HSP90α/β蛋白質(zhì)在胃癌組織中的表達(dá)分析HSP90α/β蛋白質(zhì)在正常胃黏膜組織、癌旁組織及胃癌組織中的陽性表達(dá)率分別為11.76%(4/34)、30.77%(8/26)和65.43%(53/81)。胃癌組織中HSP90α/β蛋白質(zhì)的陽性表達(dá)率高于正常胃黏膜組織和癌旁組織,癌旁組織中該蛋白質(zhì)的陽性表達(dá)率高于正常胃黏膜組織(表1,P<0.05)。高、中和低分化腺癌中該蛋白質(zhì)的陽性表達(dá)率分別為40.00%(2/5)、58.82%(10/17)和69.49%(41/59)?;颊邿o淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中陽性表達(dá)率分別為42.31%(11/26)和69.09%(38/55),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者該蛋白的陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(表1,P<0.05)。胃癌組織中Ⅰ~Ⅱ期和Ⅲ~Ⅳ期陽性表達(dá)率分別為56.25%(18/32)和79.59%(39/49),Ⅲ~Ⅳ期患者組織中該蛋白的陽性表達(dá)率高于Ⅰ~Ⅱ期(表1,P<0.05)。結(jié)果顯示,隨著胃癌分化程度的降低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生及TNM分期的增加,HSP90α/β蛋白質(zhì)的陽性表達(dá)率則升高。

    圖1 免疫組織化學(xué)染色觀察HSP90α/β蛋白質(zhì)的表達(dá)(400×) A:正常胃黏膜;B:癌旁組織;C:高分化腺癌;D:中分化腺癌;E:低分化腺癌

    表1HSP90α/β蛋白質(zhì)的陽性表達(dá)分析

    指標(biāo)nHSP90α/β蛋白質(zhì)表達(dá)-+~+++陽性率(%)χ2性別男性56263053.57女性25121352.00正常胃黏膜3430411.76癌旁組織2618830.77a4.12胃癌組織高分化腺癌53240.00a5.36中分化腺癌1791058.82a10.47低分化腺癌59194169.49ab27.83,10.44腫塊大小﹥3.0cm49173265.31≤3.0cm32112165.66淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無26151142.31有55173869.09c5.3TNM分期Ⅰ~Ⅱ32131856.25Ⅲ~Ⅳ49103979.59d4.3

    與正常胃黏膜組織比較,a:P<0.05;與癌旁組織比較,b:P<0.05;與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較,c:P<0.05;與TNM分期Ⅰ~Ⅱ期比較,d:P<0.05

    3 討 論

    胃癌的發(fā)生、發(fā)展涉及多基因參與、多階段演進(jìn)的復(fù)雜病理學(xué)過程。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不斷更新,許多未知胃癌相關(guān)蛋白質(zhì)不斷被發(fā)現(xiàn),為尋找胃癌早期診斷的蛋白質(zhì)提供了大量的資料,使獲得胃癌早期診斷的分子標(biāo)志物提供了可能。目前已有許多胃癌相關(guān)的蛋白質(zhì)分子已經(jīng)被證實(shí),如CA19-9[5]、CEA[6]、Span-1[7]等,但是至今仍無用于胃癌早期診斷的蛋白質(zhì)。本課題組前期采用顯微切割與定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)相結(jié)合,篩選獲得了一系列胃癌相關(guān)的蛋白,選取其中差異倍數(shù)較大且胃癌相關(guān)的蛋白質(zhì)HSP90α/β,分析該蛋白質(zhì)在胃癌中的表達(dá)情況及臨床意義,為胃癌的早期診斷及預(yù)后評(píng)估等提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)資料。

    1962年,Ritossa在研究果蠅唾液腺時(shí)發(fā)現(xiàn),熱應(yīng)激環(huán)境下大部分蛋白質(zhì)合成均被抑制,但有一組特殊蛋白質(zhì)合成卻被激活,即熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)[8]。有研究表明HSP與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、耐藥及預(yù)后關(guān)系密切,許多研究證實(shí)HSP在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、鼻咽癌等組織中均高表達(dá),該蛋白對(duì)腫瘤的診斷和預(yù)后評(píng)估具有重要的意義[9-10]。熱休克蛋白90α/β(heat shock protein 90α/β,HSP90α/β)屬于熱休克蛋白家族成員之一,普遍存在于各物種中,其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)高度保守,為細(xì)胞生存所必需的分子伴侶(molecular chaperon)蛋白之一[11]。HSP90蛋白分子量約 90kD,是一種疏水性蛋白,常以二聚體形式存在并發(fā)揮作用,應(yīng)激情況下該蛋白的疏水性增加形成寡聚體。HSP90蛋白作為分子伴侶,具有廣泛的蛋白結(jié)合譜,如激酶、磷酯酶、熱休克因子-1、多種核受體、鈣調(diào)素、肌動(dòng)蛋白、蛋白酶體、微管蛋白和鈣激活蛋白酶等[12]。HSP90蛋白可在應(yīng)激(幾乎所有細(xì)胞理化環(huán)境改變及機(jī)體的疾病與創(chuàng)傷)情況下被誘導(dǎo)性高表達(dá),其功能具有在應(yīng)激條件下糾正細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生的錯(cuò)誤折疊,對(duì)細(xì)胞應(yīng)激過程中具有重要的保護(hù)作用。HSP90蛋白作為分子伴侶,通過低親和力的結(jié)合與解聚,維持相關(guān)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定構(gòu)象,參與蛋白質(zhì)折疊、裝配、轉(zhuǎn)位與損傷修復(fù)等,使細(xì)胞信號(hào)分子形成與維持正確構(gòu)象發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)功能[13]。另外,HSP90蛋白質(zhì)也參與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等調(diào)控過程[14-16]。本結(jié)果顯示,胃癌組織中HSP90α/β蛋白質(zhì)表達(dá)水平較正常胃黏膜組織與癌旁組織高,且低分化胃癌組織較高分化胃癌組織陽性表達(dá)率高,以及癌旁組織較正常胃黏膜組織高,結(jié)果與以往許多研究者在多種腫瘤中的基本一致,根據(jù)HSP90α/β蛋白質(zhì)作為分子伴侶,參與正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞中的多種信號(hào)途徑的傳遞,參與細(xì)胞周期、凋亡等多種功能,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,推測(cè)HSP90α/β蛋白質(zhì)的高表達(dá)在胃黏膜癌變過程發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能,該蛋白的高表達(dá)對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)眾多蛋白分子的穩(wěn)定生物學(xué)功能尤為重要,尤其是涉及細(xì)胞增殖、凋亡與細(xì)胞周期的蛋白質(zhì)。深入揭示HSP90α/β蛋白質(zhì)在胃癌中的調(diào)控分子機(jī)制,對(duì)闡明胃癌發(fā)病的分子機(jī)制可能具有非常重要的意義。HSP90α/β蛋白有望成為胃癌早期診斷、治療與臨床預(yù)后評(píng)估分子標(biāo)記物,以及胃癌治療時(shí)非常有效的分子靶標(biāo)。

    總之,本研究結(jié)果初步分析了HSP90α/β蛋白質(zhì)在胃癌組織中的表達(dá)情況,為后續(xù)尋找胃癌早期診斷、治療及臨床預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)記物提供了有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)資料,然而,基于胃癌發(fā)生與發(fā)展的復(fù)雜性和不同個(gè)體間的遺傳學(xué)差異,且本研究時(shí)樣本量小,因此臨床采用前仍需后續(xù)大樣本的進(jìn)一步分析與評(píng)估。

    [1] 陳萬青,張思維,鄭榮壽,等.中國腫瘤登記地區(qū)2007年腫瘤發(fā)病和死亡分析[J].中國腫瘤,2011,20(3):162-169.

    [2] Duraes C,Almeida GM,Seruca R,et al.Biomarkers for gastric cancer:prognostic,predictive or targets of therapy[J].Virchows Arch,2014,464(3):367-378.

    [3] 趙強(qiáng),張志偉,劉重元,等.PKCα-Annexin A2-S100A10在胃癌組織中的表達(dá)及意義[J].世界華人消化雜志,2014,22(13):1793-1800.

    [4] 陳蘇瓊.LCM結(jié)合定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選胃癌組織差異表達(dá)蛋白質(zhì)[C].衡陽:南華大學(xué),2011:1-68.

    [5] Kwon OK,Yu W,Chung H.Prognostic value of postoperative CA19-9 normalization in patients with advanced gastric cancer[J].Hepatogastroenterology,2013,60(122):240-243.

    [6] Sisik A,Kaya M,Bas G,et al.CEA and CA 19-9 are still valuable markers for the prognosis of colorectal and gastric cancer patients[J].Asian Pac J Cancer Prev,2013,14(7):4289-4294.

    [7] Kubo N,Ohira M,Sakurai K,et al.SPan-1 is a useful prognostic marker for patients with stage IV gastric cancer who underwent palliative gastrectomy:a retrospective multivariate study[J].World J Surg,2013,37(7):1681-1687.

    [8] Sharp FR,Zhan X,Liu DZ.Heat shock proteins in the brain:role of Hsp70,Hsp 27,and HO-1 (Hsp32) and their therapeutic potential[J].Transl Stroke Res,2013,4(6):685-692.

    [9] Kim HS,Kang D,Moon MH,et al.Identification of pancreatic cancer-associated tumor antigen from HSP-enriched tumor lysate-pulsed human dendritic cells[J].Yonsei Med J,2014,55(4):1014-1027.

    [10] Rappa F,Farina F,Zummo G,et al.HSP-molecular chaperones in cancer biogenesis and tumor therapy:an overview[J].Anticancer Res,2012,32(12):5139-5150.

    [11] Li J,Buchner J.Structure function and regulation of the hsp90 machinery[J].Biomed J,2013,36(3):106-117.

    [12] Barrott JJ,Haystead TA.Hsp90,an unlikely ally in the war on cancer[J].FEBS J,2013,280(6):1381-1396.

    [13] Hong DS,Banerji U,Tavana B,et al.Targeting the molecular chaperone heat shock protein 90 (HSP90):lessons learned and future directions[J].Cancer Treat Rev,2013,39(4):375-387.

    [14] Jackson SE.Hsp90:structure and function[J].Top Curr Chem,2013,328:155-240.

    [15] Fan XX,Li N,Wu JL,et al.Celastrol induces apoptosis in gefitinib-resistant non-small cell lung cancer cells via caspases-dependent pathways and Hsp90 client protein degradation[J].Molecules,2014,19(3):3508-3522.

    [16] Lorenz OR,Freiburger L,Rutz DA,et al.Modulation of the Hsp90 chaperone cycle by a stringent client protein[J].Mol Cell,2014,53(6):941-953.

    TheClinicalSignificanceandExpressionofHSP90α/βProteininGastricCancerTissue

    LEI Yan,ZHANG Zhiwei,LIU Zhongyuan,et al

    (CancerResearchInstitute,UniversityofSouthChina;KeyLaboratoryofCancerCellularandMolecularPathologyinHunanProvince,Hengyang,Hunan421001,China)

    ObjectiveTo verify clinical significance of the expression of heat shock protein 90α/β (HSP90α/β) protein in gastric cancer tissue and provide valuable experiment data for gastric cancer patients on early diagnosis and clinical pathology grouping.MethodsThe expression of HSP90α/β protein was observed by immunohistochemistry staining in normal gastric mucosa tissue,cancer side tissue and gastric cancer tissue.Then the clinical pathology significance of the expression of HSP90α/β protein was analyzed.ResultsThe immunohistostaining results showed that the expressin positive rate of HSP90α/β protein was higher in gastric cancer tissue than that in normal gastric mucosa and cancer side tissue (P<0.05),in cancer side tissue than that in normal gastric mucosa tissue (P<0.05),in lymphaden metastatic gastric cancer tissue than that in no lymphaden metastatic gastric cancer tissue (P<0.05) and inⅢ~Ⅳperiod patient gastric cancer tissue than that in Ⅰ~Ⅱperiod (P<0.05).ConclusionThe expression of HSP90α/β protein was related with gastric cancer effluence,gastric cancer differentaiation level,lymphaden metastasis and TNM classification of gastric cancer.As the differentaiation level of gastric cancer tissue decreased,lymphaden metastasis of gastric cancer and TNM classification increased,the expression rate of HSP90α/β protein was also heightened.

    gastric cancer; HSP90α/β protein; clinical significance

    10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.06.003

    2015-06-11;

    2015-10-25

    湖南省自然科學(xué)衡陽聯(lián)合基金(No.12JJ9033);湖南省自然科學(xué)基金(No.13JJ3079);湖南省科技廳項(xiàng)目(No.2013SK3118;2014SK3081;2014sk3073);湖南省高校創(chuàng)新平臺(tái)基金(No.12K094、No.13K082);衡陽市科技局項(xiàng)目(2013KJ02;2013KJ12;2013KJ28).

    *通訊作者,E-mail:nhdxzzw@qq.com.

    R735.2

    A

    (此文編輯:蔣湘蓮)

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