不同馴化手段下多氯聯(lián)苯降解菌群落結(jié)構(gòu)差異分析

不同馴化手段下多氯聯(lián)苯降解菌群落結(jié)構(gòu)差異分析

梁文涓1,閆 勇2

(1.沈陽建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，遼寧沈陽 110168；2.沈陽建筑大學(xué)土木工程學(xué)院，遼寧沈陽 110168)

摘要[目的] 研究不同馴化手段下多氯聯(lián)苯降解菌群落結(jié)構(gòu)差異,為多氯聯(lián)苯污染場(chǎng)址的生態(tài)修復(fù)提供借鑒。[方法] 應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)8種馴化手段下的活性污泥進(jìn)行分析。[結(jié)果]加入同一種PCB單品的體系中，生物群落的相似度相對(duì)較高；好氧體系之間的相似性較好氧與厭氧體系之間的相似性要高；在好氧條件下，高氯PCB體系較低氯PCB體系中生物相豐富；好氧體系較厭氧體系的生物相豐富；一些物種在好氧體系和厭氧體系中均存在。[結(jié)論]該研究有利于多氯聯(lián)苯降解菌庫的充實(shí)和完善。

關(guān)鍵詞多氯聯(lián)苯；PCR-DGGE；活性污泥；群落結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)S188;X171.4

作者簡(jiǎn)介梁文涓(1990-)，女，山西長(zhǎng)治人，碩士研究生，研究方向：污染修復(fù)生態(tài)學(xué)。

收稿日期2015-06-01

Analysis on the Community Structure of PCBs Degrading Bacteria under Different Domestication Means

LIANG Wen-juan1, YAN Yong2(1. School of Municipal and Environmental Engineering, Shenyang Jianzhu University, Shenyang, Liaoning 110168; 2. School of Civil Engineering, Shenyang Jianzhu University, Shenyang, Liaoning 110168)

Abstract[Objective] The aim was to analyze the differences of community structure of PCBs degrading bacteria under different means of domestication means, and provide references for the ecological restoration of contaminated sites by polychlorinated biphenyls.[Method] PCR-DGGE technology was used to analyze the activated sludges under 8 kinds of domesticated methods. [Result] To join the same kind of PCB item system, the similarity of biological communities was relatively high; In aerobic system the similarity was higher than between aerobic and anaerobic systems; Under aerobic conditions, biological phase in the high chlorine PCB system was richer than in low chloride PCB system; biological phase in aerobic system was recher than the anaerobic system; Some species was exsited in aerobic system and anaerobic systems. [Conclusion]Some empirical rules were obtained, which was conductive to the enrichment and improvement of the library of PCBs degradation bacteria.

Key words Polychlorinated biphenyls; PCR-DGGE; Activated sludge; Community structure

微生物降解被認(rèn)為是PCBs在自然界中降解的主要途徑，有關(guān)此類的研究相當(dāng)活躍。近年來在其基礎(chǔ)上發(fā)展起來的應(yīng)用生物降解原理治理被污染環(huán)境的生物修復(fù)技術(shù)發(fā)展很快，由于其經(jīng)濟(jì)、安全，能處理的閾值低、殘留少，其應(yīng)用前景十分廣闊。研究不同馴化手段下多氯聯(lián)苯降解菌群落結(jié)構(gòu)差異可以為多氯聯(lián)苯污染場(chǎng)址的生態(tài)修復(fù)提供借鑒。

變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)技術(shù)是基于核酸序列的不同，將片段大小相同的DNA序列分開[1]。不同序列的DNA片段都有一個(gè)或多個(gè)溶解區(qū)域，首先在解鏈溫度較低的堿基區(qū)域開始解鏈，即DNA中A∶T堿基區(qū)域首先溶解，而G∶C含量高的區(qū)域仍保持雙鏈。部分溶解的DNA雙鏈最后停留在各自相應(yīng)的變性劑濃度下變性，發(fā)生空間構(gòu)型的變化，導(dǎo)致電泳速度急劇下降，最后在其相應(yīng)的變性劑梯度位置停滯[2]，這種電泳遷移率的差異經(jīng)過染色后可以在凝膠上呈現(xiàn)為分散的條帶。由于DNA分子中G∶C堿基對(duì)比A∶T堿基對(duì)結(jié)合更為牢固，G∶C含量高的區(qū)域需要較高的解鏈溫度。為了提高DGGE對(duì)序列差異的分辨率，通常在引物的3′端加上一個(gè)“GC夾板”(GC-clamp)，一般含有30～50個(gè)堿基，從而形成一個(gè)人工高溫解鏈區(qū)，使DNA片段的原有部分由于處在低溫解鏈區(qū)，從而實(shí)現(xiàn)更好的分離效果。通過“GC夾板”與PCR技術(shù)相結(jié)合，運(yùn)用DGGE技術(shù)可檢測(cè)PCR擴(kuò)增DNA片段的多態(tài)性，分辨具有相同或相近分子量目的片段的序列差異，進(jìn)一步分析活性污泥微生物群落中優(yōu)勢(shì)種群以及群落結(jié)構(gòu)多樣性。該技術(shù)是目前研究微生物群落結(jié)構(gòu)的主要分子生物學(xué)方法之一。筆者應(yīng)用凝膠分析軟件BandScan5.0對(duì)DGGE圖譜的條帶進(jìn)行影像定位和相似性分析，并建立系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行聚類分析。

1 材料與方法

1.1 活性污泥DNA提取取天津市紀(jì)莊子污水處理廠和天津市大沽化工污水處理廠處理過程中的活性污泥。

50 ml培養(yǎng)體系中有10 ml活性污泥混合液，加入不同的PCB單品(表1)，濃度均為5 mg/L，培養(yǎng)基成分同富集培養(yǎng)基。

按Biospin Bacteria Genomic DNA提取試劑盒的使用說明書對(duì)上述預(yù)處理后污泥混合液的細(xì)菌DNA進(jìn)行提取，最終得到100 μl DNA溶液置于-20 ℃冷凍保存。對(duì)編號(hào)1～8活性污泥體系的DNA逐一進(jìn)行提取。

表1　 DNA提取體系

注：1～6為好氧降解體系，7和8為厭氧降解體系。

提取出的DNA溶液在1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)，電泳條件：電壓120 V，上樣液為6×Loading Buffer，上樣比例為DNA溶液10 μl+6×Loading Buffer 2 μl，每個(gè)DNA提取體系設(shè)2個(gè)上樣點(diǎn)，每個(gè)泳道上樣量為20 μl，Marker為λ Hind III，電泳時(shí)間為50 min。

1.2 PCR擴(kuò)增將提取的基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物1為帶有一“GC夾”[3](5′-CGCCCGCCGCGCGGCGGCGGGCGGGGCGGCACGGGGGG-3′)的357F(5′-GC clamp-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′)；擴(kuò)增引物2為518R(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)約為600 bp[4]，引物濃度調(diào)節(jié)到0.1～1.0 μmol/L。

（3）項(xiàng)目直接負(fù)責(zé)的單位領(lǐng)導(dǎo)層，沒有基本的責(zé)任意識(shí)，再者缺乏專業(yè)的項(xiàng)目指導(dǎo)，也沒有專業(yè)的技術(shù)支持團(tuán)隊(duì)，因此很難保證工程的質(zhì)量。一般存在于項(xiàng)目前期階段不完整，施工中形成的更多的矛盾，使施工方疲于應(yīng)付各種局部的矛盾，削弱了能源管理的質(zhì)量。，總而言之，巧婦難為無米之炊，專業(yè)設(shè)備投資力度不夠，技術(shù)水平不到位，再加上沒有資深的專業(yè)技術(shù)人員和施工團(tuán)隊(duì)，也沒有核心的管理的網(wǎng)系關(guān)系，施工團(tuán)隊(duì)組織渙散，好像打仗的軍隊(duì)潰不成軍，如何能夠保證效率和質(zhì)量。

50 μl反應(yīng)體系：1 μl DNA模板，25 μl 2×PCR Master Mix(含有3 mmol MgCl2、0.2 mmol/L的dNTP、0.1 U/μl的TaqDNA聚合酶和2×PCR緩沖液)，2 μl引物1，2 μl引物2，其余用無菌超純水補(bǔ)足50 μl[5]。

PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下延伸2 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)。電泳條件：電壓90 V，每個(gè)泳道上樣量為15 μl，Marker為λ Hind III ，電泳時(shí)間為50 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

1.3.1 PCR產(chǎn)物變性梯度凝膠電泳分析。將總細(xì)菌PCR產(chǎn)物用變性梯度凝膠電泳分離，電泳緩沖液為1×TAE。使用梯度混合器制備6%～l2%的聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度30%～50%。在150 V、60 ℃的條件下電泳6.5 h。電泳完畢后，將凝膠進(jìn)行硝酸銀染色。

1.3.2 DGGE圖譜分析。應(yīng)用凝膠圖像分析軟件BandScan5.0對(duì)掃描所得的DGGE圖譜進(jìn)行條帶分析，獲取條帶的數(shù)字化信息，然后用NTSYS-PC軟件計(jì)算材料間的Dice遺傳相似系數(shù)進(jìn)行相似度分析，按不加權(quán)成對(duì)算術(shù)平均法(UPGMA)建立系統(tǒng)聚類分支樹狀圖進(jìn)行聚類分析，評(píng)價(jià)樣品微生物群落結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果將PCR產(chǎn)物取樣15 μl進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，結(jié)果見圖1。

2.2 變性梯度凝膠電泳分離擴(kuò)增結(jié)果將8個(gè)馴化體系所得的16S rRNA片段通過變性梯度凝膠電泳。應(yīng)用凝膠分析軟件BandScan對(duì)掃描所得的DGGE圖譜進(jìn)行條帶分析，獲取條帶的數(shù)字化信息。由圖2可知，分離得到一系列條帶，根據(jù)條帶對(duì)比的結(jié)果，根據(jù)戴斯系數(shù)(Dice coefficient)計(jì)算出各樣品相似性矩陣(表2)，最大相似度為0.806(體系5和體系6)，最小相似度為0.627(體系2和體系4)。相似性高說明體系中生物群落相似性越高；相似性低說明微生物群落多樣化。

由圖3可知，1～6好氧體系中，來自大沽化工廠活性污泥的體系條帶個(gè)數(shù)明顯多于紀(jì)莊子污水處理廠。天津大沽化工廠以食鹽電解為基礎(chǔ)，另外還生產(chǎn)燒堿、聚氯乙烯樹脂、環(huán)氧丙烷、聚醚、液體氯、合成鹽酸等產(chǎn)品，是一家綜合性大型氯堿企業(yè)，該廠廢水的含氯有機(jī)物種類繁多，造成了活性污泥中特殊的微生物群落。因此，大沽化工廠的污泥中適應(yīng)PCBs的微生物相明顯比處理生活污水的紀(jì)莊子污水處理廠污泥的微生物相豐富。該研究中厭氧體系只有2個(gè)，可以作為對(duì)照。

在四氯代的體系中(體系3、4、7、8)，好氧條件下，大沽化工廠的污泥體系(體系4)可利用PCBs的微生物比紀(jì)莊子的污泥體系(體系3)豐富；而厭氧條件下，紀(jì)莊子的污泥體系(體系4)可利用PCBs的微生物比大沽化工廠的污泥體系(體系3)豐富。

從氯取代的個(gè)數(shù)來看，可利用四氯代的PCBs微生物可能比可利用二氯聯(lián)苯、五氯聯(lián)苯的種類更多。

表2　 8個(gè)馴化體系微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性矩陣

由圖2可知，每個(gè)樣品各分離出不同位置的電泳條帶，各條帶的形成是基于PCR產(chǎn)物產(chǎn)量和遷移率的不同，因此可以表征污泥樣品中優(yōu)勢(shì)菌群的分布[6]。根據(jù)DGGE對(duì)不同DNA片段的分離原理，可以得知樣品的PCR產(chǎn)物中既含有相同的DNA片斷，也含有多種不同的DNA片斷。從原理上，每一個(gè)片斷可以代表一個(gè)微生物種屬，條帶信號(hào)越強(qiáng)，該種屬在污泥中具有越明顯的優(yōu)勢(shì)地位。

2.3 聚類分析通過NTSYS-PC軟件對(duì)DGGE指紋圖譜進(jìn)行UPGMA聚類分析(圖4)。當(dāng)相似度為0.72時(shí)，8個(gè)體系可聚為3類。

類I包含2個(gè)體系，分別是：添加二氯聯(lián)苯(2,2′-二氯聯(lián)苯)和紀(jì)莊子污水處理廠活性污泥的好氧體系(編號(hào)1)、添加二氯聯(lián)苯(2,2′-二氯聯(lián)苯)和大沽化工廠活性污泥的好氧體系(編號(hào)2)。兩者均為好氧培養(yǎng)條件下添加二氯聯(lián)苯(2,2′-二氯聯(lián)苯)的體系。

類II有5個(gè)體系，分別是：添加四氯聯(lián)苯(3,3′,4,4′-四氯聯(lián)苯)的紀(jì)莊子污水處理廠的好氧體系(編號(hào)3)、添加四氯聯(lián)苯(3,3′,4,4′-四氯聯(lián)苯)的大沽化工廠活性污泥的好氧體系(編號(hào)4)、添加五氯聯(lián)苯(2,2′,3,4,5-五氯聯(lián)苯)的紀(jì)莊子污水處理廠活性污泥的好氧體系(編號(hào)5)、添加五氯聯(lián)苯(2,2′,3,4,5-五氯聯(lián)苯)的大沽化工廠活性污泥的好氧體系(編號(hào)6)、添加四氯聯(lián)苯(3,3′,4,4′-四氯聯(lián)苯)的紀(jì)莊子化工廠活性污泥的厭氧體系(編號(hào)7)。

類III只有一個(gè)體系：添加四氯聯(lián)苯(3,3′,4,4′-四氯聯(lián)苯)的大沽化工廠活性污泥的厭氧體系(編號(hào)8)。

3 結(jié)論與討論

該研究總體呈現(xiàn)如下規(guī)律：①加入同一種多氯聯(lián)苯單品的體系中，生物群落的相似度相對(duì)較高；②好氧體系之間的相似性較好氧與厭氧體系之間的相似性要高；③在好氧條件下，高氯PCB體系較低氯PCB體系中生物相豐富；④好氧體系較厭氧體系的生物相豐富；⑤一些物種在好氧體系和厭氧體系中均存在。

采用不同馴化手段分析了多氯聯(lián)苯降解菌群落結(jié)構(gòu)差異性，該研究主要從好氧、厭氧，以及加入不同的多氯聯(lián)苯單品形成不同的馴化環(huán)境，對(duì)多氯聯(lián)苯降解菌進(jìn)行定向馴化。通過NTSYS-PC軟件對(duì)DGGE指紋圖譜進(jìn)行UPGMA聚類分析，可以了解多氯聯(lián)苯降解菌群落結(jié)構(gòu)差異性以及相關(guān)性，得出一些經(jīng)驗(yàn)性的規(guī)律，有利于多氯聯(lián)苯降解菌庫的充實(shí)和完善。

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