新型N-糖鏈受體氘代MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc的合成及其受體性能

于田， 金東日

( 延邊大學長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室， 吉林 延吉 133002 )

新型N-糖鏈受體氘代MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc的合成及其受體性能

于田， 金東日*

( 延邊大學長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室， 吉林 延吉 133002 )

為利用糖鏈轉(zhuǎn)移酶反應定量分析糖蛋白N-糖鏈，首先用d8-1-甲基-4-[2,4-二硝基-5-(1-哌嗪基)苯基]哌嗪(d8-PDPZ)與Nω-(2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-Nα-(叔丁氧羰基)-L-天冬酰胺(Boc-Asn-GlcNAc)縮合反應生成d8-PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc，然后d8-PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc再與碘甲烷反應合成了新的帶正電荷的糖鏈受體d8-MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc.以Endo-M N175Q為糖鏈轉(zhuǎn)移酶、SG -Asn為糖基供體，利用UPLC-QTOF-MS對d8-MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc的糖鏈受體性能進行了初步研究.結(jié)果表明，在Endo-M N175Q的催化下，d8-MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc與SG-Asn發(fā)生酶促反應，生成糖鏈轉(zhuǎn)移產(chǎn)物d8-MPDPZ-Boc-Asn-SG.如果優(yōu)化定量反應的條件，d8-MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc可應用于糖鏈分析.

Endo-M N175Q； 受體； 糖肽； LC-MS

糖基化作用是真核生物蛋白翻譯后修飾的重要環(huán)節(jié)，其在生命活動的許多方面扮演著極其重要的角色，例如蛋白質(zhì)構(gòu)象、定位、活性和功能，以及各種生物學反應等[1].研究表明，人類許多疾病的發(fā)生和發(fā)展都與蛋白上糖鏈的結(jié)構(gòu)和表達量的改變有關(guān)，如炎癥[2]、免疫疾病[3]、腫瘤[4]和代謝綜合癥[5]等.通過定量糖組學技術(shù)可以精確地尋找疾病中糖鏈發(fā)生的異常變化，這對疾病的診斷和治療具有不可估量的作用,因此定量糖組學越來越引起科學家的關(guān)注.

目前，質(zhì)譜技術(shù)已應用于糖組學的研究中，并實現(xiàn)了糖鏈的序列測定和定性研究，但定量分析方法尚不完善.目前，基于質(zhì)譜檢測的化學標記是進行糖鏈定量的有效方法，如同位素碘甲烷的全甲基化技術(shù)[6]、同位素苯衍生物的還原端標記技術(shù)[7]等，但這些技術(shù)都需要在實驗過程中進行額外的化學反應，這不僅需要引入額外的試劑，增加反應步驟，還會產(chǎn)生副反應，給標記效率和樣品純化帶來許多不利影響.利用糖苷內(nèi)切酶轉(zhuǎn)糖基作用的方法可以很好地解決上述問題，但該方法一直沒有應用到糖鏈的定量分析.

Endo-M N175Q是一種N-糖鏈轉(zhuǎn)移酶，它不僅可以水解糖蛋白和糖肽N-糖鏈中兩個GlcNAc之間的β1-4糖苷鍵，釋放出N-糖鏈和帶有GlcNAc的蛋白或多肽，還具有轉(zhuǎn)糖基活性，能夠?qū)⒐烟擎溵D(zhuǎn)移到帶有GlcNAc標簽的化合物上，在兩個GlcNAc之間形成新的糖苷鍵，從而合成新的糖鏈化合物[8].目前，Endo-M N175Q已應用于糖肽的合成，但未見有關(guān)其在糖鏈分析中的應用.在文獻[9]，我們合成了輕同位素標記的受體d0-MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc，并利用Endo-M對糖鏈進行了定性分析.為利用Endo-M N175Q對N-糖鏈進行定量分析，本文合成重同位素標記的受體d8-MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(見圖1)，并通過質(zhì)譜對其受體性能進行初步研究，為今后N-糖鏈的定量分析提供物質(zhì)基礎.

圖1 d8-MPDPZ-Boc-Asn-GLcNAc的合成路線

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

實驗儀器有UPLC-ESI-TOF-MS(Waters)，日本島津公司Axima CFRTMplus基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-MS).

所有反應試劑均為分析純，購買后未經(jīng)處理直接使用；柱層析硅膠為青島海洋化工廠生產(chǎn)，硅膠粒度為100～200目； 1-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-4-甲基哌嗪(PPZ)、 d0-哌嗪、 4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽(DMT-MM)、Nω-(2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-Nα-(叔丁氧羰基)-L-天冬酰胺(Boc-Asn-GlcNAc)均為梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司生產(chǎn)； d8-哌嗪鹽酸鹽(2,2,3,3,5,5,6,6-d)為美國Cambrige Isotope Laboratories公司生產(chǎn)； SG -Asn為日本大塚化學公司生產(chǎn).

1.2 d8-1-甲基-4-[2,4-二硝基-5-(1-哌嗪基)苯基]哌嗪(d8-PDPZ)的合成

將25 mg (0.15 mmol) d8-哌嗪鹽酸鹽溶于1 mL甲醇和43 μL三乙胺中，在60 ℃下將溶于2 mL乙腈的64.0 mg (0.23 mmol) PPZ溶液滴入，然后回流20 min.蒸除溶劑，所得粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱分離(V二氯甲烷/V甲醇=5/1)得到黃色固體37.6 mg，產(chǎn)率為96%.1H NMR(300 MHz，CD3OD): δ 8.71(1H,s), 6.29(1H,s), 2.63(4H,s), 2.39(3H,s)；13C NMR(75 MHz，CD3OD): δ 42.94, 43.25, 43.53, 43.81, 43.83， 44.84, 50.30, 54.86, 111.45, 129.81, 133.90, 151.04.MALDI-TOF-MS (基質(zhì)為蒽三酚)：m/z359.0 [M+H]+.

1.3 d8-PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc的合成

將16.8 mg (0.036 mmol) Boc-Asn-GlcNAc溶于1 mL DMF和甲醇混合溶液中(體積比為4∶6)，在室溫下加入20 mg (0.06 mmol) DMT-MM，攪拌5 min； 然后加入19.3 mg (0.055 mmol) 1-[5-(1-哌嗪基)-2,4-二硝基苯基]-4-甲基哌嗪(d8-PDPZ)，室溫反應30 min.蒸除溶劑，加適量水后用二氯甲烷萃?。粶p壓濃縮水層，所得橙黃色粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱分離(V二氯甲烷/V甲醇=10/1)后得到12.6 mg產(chǎn)品，產(chǎn)率為50%.MALDI-TOF-MS (基質(zhì)為蒽三酚)：m/z776.3 [M+H]+.

1.4 d8-MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc的合成

1.5 Endo-M N175Q酶轉(zhuǎn)糖基反應

在20 μL 2.5 mM SG-Asn中，分別加入10 μL 4.1 mM d8-MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc、10 μL 0.1 M磷酸緩沖液(pH 6.0)和10 μL 200 mU/mL Endo-M N175Q，在30 ℃下反應30 min.取2.0 μL反應液進UPLC-ESI-TOF-MS.

1.6 UPLC-ESI-MS及HPLC-UV的檢測條件

表1和表2分別是超高效液相色譜-電噴霧-飛行時間質(zhì)譜和HPLC色譜條件.

表1 超高效液相色譜-電噴霧-飛行時間質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與討論

2.1 縮合劑的選擇

構(gòu)筑酰胺鍵的常用方法是進行伴有羧酸活化的脫水縮合反應，其活化劑有N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)/吡啶、2,2′-二吡啶二硫(DPDS)/三苯基膦(TPP)等.我們曾在d0-PDPZ與Boc-Asn-GlcNAc反應中，選用DPDS/TPP作為活化劑合成了d0-PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc,但是該方法存在副產(chǎn)物的去除等問題.三嗪縮合DMT-MM既能在傳統(tǒng)活化劑、水或質(zhì)子溶劑中使用[10]，還能在含水有機溶劑和水-有機溶劑混合體系中使用，因此具有無需將溶劑脫水的優(yōu)點.基于此，本文選用DMT-MM作活化劑合成d8-PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc.DMT-MM活化機理如圖2所示.從圖3可知，保留時間為19 min處的峰為d8-PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc的峰，其色譜純度為98.5%.

圖2 DMT-MM活化機理

圖3 d8-MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc的高效液相色譜圖

2.2 d8-MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc的受體性能

Endo-M N175Q是Endo-M的突變體，它不僅具有與Endo-M一樣的N-糖鏈轉(zhuǎn)移性能，而且也能與天然N-糖肽作用.考慮到天然N-糖肽的糖鏈定量分析，本文選用Endo-M N175Q考察d8-MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc的受體性能.為了提高待測物在電噴霧-質(zhì)譜上的檢測靈敏度以及進行基于質(zhì)譜的穩(wěn)定同位素標記糖鏈定量方法，本文合成了離子型糖鏈受體d8-MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc.d8-MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc作為酶糖鏈轉(zhuǎn)移反應的受體，只有標記酶水解下來的糖鏈，才起到受體作用.因此，本文主要考察d8-MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc能否標記糖鏈作為判斷該試劑的受體性能.以SG-Asn作為糖鏈供體、d8-MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc作為受體進行的Endo-M N175Q酶促反應見圖3，反應后對其產(chǎn)物進行UPLC-ESI-TOF-MS分析，其結(jié)果如圖4所示.從圖4可知，有m/z931.7和1 397.1的質(zhì)譜峰.從糖鏈標記物d8-SG-Asn-Boc-MPDPZ的相對分子量可推算，該m/z值分別是[M+2H]3+和[M+H]2+的峰值.由此可見，在Endo-M N175Q酶促反應中，d8-MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc確實起到了受體作用，具有受體性能.

圖4 d8-MPDPZ-Boc-Asn與SG-Asn的酶促反應

圖5 酶反應產(chǎn)物的質(zhì)譜圖

3 結(jié)論

本文以Boc-Asn-GlcNAc為母體合成了d8-MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc，由于其極性較大，易溶于水，所以有利于酶促反應的進行.在糖鏈轉(zhuǎn)移酶Endo-M N175Q存在下，d8-MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc可作為一種糖鏈受體對N-糖鏈進行同位素標記，因此該試劑為定量分析糖蛋白N-糖鏈提供了一種新的同位素標記受體.

[1] Rudd P, Elliott T, Cresswell P, et al. Glycosylation and the immune system [J]. Science, 2001,291(5512)：2370-2376.

[2] Arnold J N, Saldova R, Hamid U M A, et al. Evaluation of the serum N-linked glycome for the diagnosis of cancer and chronic inflammation[J]. Proteomics, 2008,8(16)：3284-3293.

[3] Marth J D, Grewal P K. Mammalian glycosylation in immunity [J]. Nat Rev Immunol, 2008,8(11)：874-887.

[4] Goetz J A, Mechref Y, Kang P, et al. Glycomic profiling of invasive and non-invasive breast cancer cells [J]. Glycoconj J.2009,26(2)：117-131.

[5] Butler M, Quelhas D, Critchley A J, et al. Detailed glycan analysis of serum glycoproteins of patients with congenital disorders of glycosylation indicates the specific defective glycan processing step and provides an insight into pathogenesis [J]. Glycobiology, 2003,13(9)：601-622.

[6] Tao W A, Aebersold R. Advances in quantitative proteomics via stable isotope tagging and mass spectrometry[J]. Curr Opin Biotechnol, 2003,14 (1)：110-118.

[7] Zhang P, Zhang Y, Xue X, et al. Relative quantitation of glycans using stable isotopic labels 1-(d0/d5)phenyl-3-methyl-5-pyrazolone by mass spectrometry[J]. Anal Biochem, 2011,418(1)：1-9.

[8] Yamamoto K, Kasowaki S, Watanabe J, et al. Transglcoscylation activity of Mucor hiemalis endo-beta-N-acetyl-glycosaminidase which transfers complex oligosaccharides to the N-acetylglycosamine moieties of peptides[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1994,203(1)：244-252.

[9] Min J Z, Suzuki Y, Tomiyasu Y, et al. Development of novel active acceptors possessing a positively chaged structure for the transglycosylation reaction with Endo-M and their application to oligosaccharide analysis[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2011,25(19)：2911-2922.

[10] Kunishima M, Kawachi C, Hioki K, et al. Formation of carboxamides by direct condensation of carboxylic acids and amines in alcohols using a new alcohol- and water-soluble condensing agent: DMT-MM[J]. Tetrahedron, 2001,57(8)：1551-1558.

Synthesis and acceptor performance of a new N-linked oligosaccharide acceptor： deuterium MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc

YU Tian, JIN Dongri*

(KeyLaboratoryofNaturalResourcesofChangbaiMountainandFunctionalMolecules(YanbianUniversity),MinistryofEducation,Yanji133002,China)

To quantitative analysis of N-linked oligosaccharides in glycoproteins using transglycosylation reaction, then a permanently positively charged kind and new accepter d8-MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc was synthesized based on a methylation reaction of methyliodide and d8-PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc, which was prepared through a condensation reaction of 1-(2,4-Dinitro-5-(piperazin-1-yl)phenyl)-4-methylpiperazine (d8-PDPZ) andNω-(2-acetanido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-Nα-(tert-butoxycarbonyl)-L-asparagine (Boc-Asn-GlcNAc). The performance of d8-MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc was investigated by UPLC-ESI-TOF-MS with Endo-M N175Q as enzyme, SG -Asn as donor. The results indicated that the acceptor enzymatically reacted with SG-Asn in the presence of Endo-M N175Q, tansglycosylation product d8-MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc-SG is obtained. Thus, d8-MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc will be used to analyze the oligosaccharides if the quantitative transglycosylation reaction condition is optimized.Key words： Endo-M N175Q； accepter; glycopeptide； LC-MS

2015-01-26 基金項目： 國家自然科學基金資助項目(21365022)

1004-4353(2015)01-0030-04

O626

A

*通信作者： 金東日(1965—)，男，教授，研究方向為藥物分析.