包覆相脂解酶的特性研究

摘要：文章系利用硅酸（由tetramethoxysilane水解產(chǎn)生）及polyallylamine進(jìn)行仿生氧化硅包覆脂解酶（from Pseudomonas cepacia），并以包覆后脂解酶催化大豆油或廢食用油與甲醇進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)。以反應(yīng)曲面法和Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)探討反應(yīng)溫度、受質(zhì)莫耳比（methanol/oil）、含水量（w/w of oil）對(duì)生質(zhì)柴油含量的影響。

關(guān)鍵詞：包覆；相脂解酶；硅酸；催化特性；脂肪酸 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：TQ645 文章編號(hào)：1009-2374（2015）31-0005-02 DOI：10.13535/j.cnki.11-4406/n.2015.31.003

1 脂解酶簡介

1.1 脂解酶根據(jù)其催化特性分類

1.1.1 非特異性脂解酶（non-specific lipase）。此類脂解酶并不對(duì)三酸甘油酯的酯鍵有選擇性，即脂解酶對(duì)三個(gè)酯鍵均可以進(jìn)行反應(yīng)（如水解、轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)）。

1.1.2 1，3特異性脂解酶（1，3-specific lipase）。此類脂解酶只會(huì)對(duì)三酸甘油酯上之第1、3位之酯鍵進(jìn)行反應(yīng)，第2位之酯鍵則否。以水解三酸甘油酯為例：當(dāng)1，3特定位脂解酶將三酸甘油酯水解成1，2或（2，3）-diglycerides，此時(shí)第2位酯鍵會(huì)自發(fā)性進(jìn)行?；D(zhuǎn)移（acyl migration）至第1或（3）位，進(jìn)而再被1，3特異性脂解酶水解。

1.1.3 特定脂肪酸脂解酶（fatty acid specific lipase）。如Geotricbum candidium生產(chǎn)之脂解酶只對(duì)特定結(jié)構(gòu)之脂肪酸有活性。此脂解酶只對(duì)三酸甘油酯中，第九個(gè)碳上有順式雙鍵的不飽和脂肪酸進(jìn)行反應(yīng)。對(duì)于飽和脂肪酸（無雙鍵）、第九個(gè)碳上為單鍵則無反應(yīng)。

1.2 生理及物理之特性

1.2.1 微生物脂解酶通常比植物或動(dòng)物脂解酶更具穩(wěn)定性。

1.2.2 嗜熱微生物脂解酶在高溫與不利的化學(xué)環(huán)境下較為穩(wěn)定，極具工業(yè)應(yīng)用之潛力。

1.2.3 由于酵素的專一性，不必要的副產(chǎn)物可以減少。

脂解酶是水解酵素的成員之一，作用于羧酸酯鍵。其生理角色是水解三酸甘油酯產(chǎn)生雙酸甘油酯、單酸甘油酯、脂肪酸、甘油。除了可水解羧酸酯鍵，脂解酶亦可在非水相環(huán)境下催化酯化反應(yīng)、內(nèi)酯化反應(yīng)、轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)。因此，多元化的催化能力使得脂解酶可以應(yīng)用于食品、清潔劑、制藥、皮革、紡織、化妝品、造紙工業(yè)等（Hasan et al.，2006）。

2 Pseudomonas cepacia脂解酶介紹

在醇解反應(yīng)中探討不同微生物來源之脂解酶，其中Pseudomonas cepacia脂解酶催化醇解反應(yīng)并加入油重1～20wt%之水分，反應(yīng)90h后脂肪酸甲酯含量超過80%。當(dāng)水含量低時(shí)，Candida rugosa及P.fluorescens脂解酶其反應(yīng)速度顯著下降，顯示水可避免甲醇使這些酵素失活。另外，P.cepacia脂解酶于醇解反應(yīng)中醇油莫耳比高達(dá)2∶1或3∶1時(shí)，仍能達(dá)到高甲基酯含量，故P.cepacia脂解酶較其他微生物來源之脂解酶對(duì)醇類耐受性較高。

以X-ray結(jié)晶法分析P.cepacia脂解酶在無抑制劑下之結(jié)晶結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)顯示脂解酶含有α/β水解酶折迭以及三個(gè)具催化活性之殘基Ser87、His286、Asp264。此酵素與同源之P.glumae脂解酶及Chromobacterium viscosum脂解酶在結(jié)構(gòu)上有數(shù)個(gè)共通點(diǎn)，其中包含Ca2+結(jié)合位。此脂解酶呈現(xiàn)openconformation，其中包含溶劑可接觸之活性位；相較于P.glumae脂解酶，其活性位隱藏于關(guān)上之“l(fā)id”之下。P.cepacia脂解酶之open conformation顯示此酵素可在油水接口活化，活化時(shí)應(yīng)伴隨二級(jí)結(jié)構(gòu)之調(diào)整使“l(fā)id”開啟，將活化位暴露于外。

3 包覆相脂解酶活性分析

（1）包覆相脂解酶活性測量方法是將810μL的50mM Tris HCl buffer，pH8.0（含有0.4% TritonX-100及0.1%arabic gum）、90μL pNPL與100μL包覆相脂解酶溶液混合；（2）將此反應(yīng)置于hybridization oven中反應(yīng)溫度37℃，50rpm，反應(yīng)10min；（3）離心5min后抽取上清液，以去離子水稀釋10倍后在A410下測量其吸收，再利用pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算活性。

4 制備包覆相脂解酶

（1）取228μL tetramethoxysilane（TMOS）并加入1272μL 1mM HCl，于室溫下反應(yīng)15min使其水解，最終濃度為1M。由于水解后之TMOS長時(shí)間儲(chǔ)存會(huì)凝結(jié)成膠，故每次包覆前均需準(zhǔn)備全新之TMOS水解溶液；（2）包覆之反應(yīng)溶液中包含7.5mL 0.1M KH2PO4（pH7.8，含有0.1NNaOH）、1.5mL 1M TMOS、1.5mL 500mg/mL脂解酶與1.5mL去離子水，最后加入3mL 5mM PAA以起始反應(yīng)；（3）于室溫下反應(yīng)5min后，以離心（×100g，2min）進(jìn)行固液分離并抽出上清液，接著使用15mL去離子水清洗包覆相脂解酶兩次，懸浮于去離子水中，最后將其冷凍干燥備用；（4）包覆效率系以下列公式計(jì)算：，殘余脂解酶量系指上清液及清洗液中脂解酶之含量，測定其脂解酶之活性，并由脂解酶濃度-活性標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算；（5）活性回收系以下列公式計(jì)算：。

5 包覆相脂解酶之特性

本研究中包覆效率（包覆相酵素質(zhì)量/添加酵素質(zhì)量）為93%±9%。未包覆脂解酶其比活性為24±11U/mg，包覆相脂解酶之比活性為15±8U/mg；平均活性回收（包覆相脂解酶比活性/液相脂解酶比活性）為58±5%，以上實(shí)驗(yàn)次數(shù)均為5次。先前研究中以TMOS將P.cepacia脂解酶包覆；其包覆率為96%，活性回收為51%，與本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近。而McAuliffe等人（2005）以polyethyleneimine（PEI）催化仿生氧化硅形成，用以包覆脂解酶，其活性回收低于10%；明顯較本研究為低。

經(jīng)鉬硅酸鹽比色法之結(jié)果顯示，以PAA為形成氧化硅之模板，其氧化硅產(chǎn)量為每100μl反應(yīng)體積產(chǎn)生0.73±0.09mg（N=3），可換算出酵素承載量為6.7±0.8g脂解酶/g SiO2（N=3）。Pencreac'h與Baratti指出Amano公司之商業(yè)化脂解酶，經(jīng)過Lowry法之檢測，脂解酶粉末所含之蛋白質(zhì)約只占其質(zhì)量6%（60mg/g powder，6%），水分約占2.3%。相較于Chen等人之研究結(jié)果，其氧化硅產(chǎn)量為每100μL反應(yīng)體積產(chǎn)生0.24mg；其原因可能為本研究采用PAA之濃度為5倍（5mM vs.1mM），先前研究指出氧化硅生成量與催化劑使用濃度有關(guān)。

6 轉(zhuǎn)酯化條件

無論有無包含脂解酶或經(jīng)冷凍干燥處理，其形態(tài)并無明顯之差異，均為顆粒與顆粒彼此相互融合或團(tuán)聚而形成之結(jié)構(gòu)。為準(zhǔn)確控制含水量，采經(jīng)冷凍干燥后之包覆相脂解酶進(jìn)行生質(zhì)柴油轉(zhuǎn)化。

進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)時(shí)，許多條件均會(huì)影響轉(zhuǎn)酯化之結(jié)果，如反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、醇油莫耳比、甲醇批次添加與否、含水量、酵素添加量等。以上諸多因子中選取有影響性之因子，再以反應(yīng)曲面法探討因子間之交互關(guān)系并找出最適化之反應(yīng)條件。

制備生質(zhì)柴油最常以蔬菜油為原料，但其成本過于高昂又有與民爭食之疑慮，因此，選擇成本較低廉之廢食用油是為經(jīng)濟(jì)又環(huán)保的做法。

大豆油與廢食用油之酸價(jià)分別為0.3±0.1、1.4±0.1mg KOH/g（N=3），顯示廢食用油于使用過程中可能發(fā)生氧化及水解，使酸價(jià)較大豆油高約5倍。而本研究所使用之大豆油及廢食用油之皂化價(jià)分為175及195mg KOH/g，兩者無明顯差距。

7 結(jié)語

溫度是決定酵素反應(yīng)速率的因素之一，在一定的溫度范圍內(nèi)酵素活性隨溫度升高而增加。高于此溫度范圍后，酵素之構(gòu)型改變造成不可逆之活性喪失；低溫時(shí)，酵素作用減緩，然其活性可藉由升溫再度回復(fù)。

Noureddini等人研究固定化P.cepacia脂解酶之最適溫度，發(fā)現(xiàn)于35℃時(shí)有最佳之轉(zhuǎn)酯化活性。以反應(yīng)曲面法探討生質(zhì)柴油之反應(yīng)溫度（40℃、50℃、60℃），結(jié)果最佳溫度為52.1℃。

作者簡介：李志紅（1981-），女，義馬煤業(yè)集團(tuán)煤生化高科技工程有限公司助理工程師，研究方向：生物科學(xué)技術(shù)。

（責(zé)任編輯：周 瓊）