高溫高壓提取甜菜廢粕多糖的工藝及其抗氧化性研究

趙亞紅，王文俠，張顯斌，尚慶，李長娟

(齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾，161006)

在甜菜制糖過程中，甜菜充分提取蔗糖后的菜絲稱為廢粕，甜菜廢粕是甜菜制糖的副產(chǎn)物。2011年我國甜菜總產(chǎn)量1 073.1萬t，占全球總產(chǎn)量的4.3%左右［1］。我國甜菜種植面積高達(dá)25萬hm2，主要分布在黑龍江、新疆、內(nèi)蒙古等北方地區(qū)。每噸甜菜制糖后可得到大約0.15 t干渣，我國甜菜廢粕資源極其豐富。甜菜廢粕主要成分是碳水化合物，其中糖醛酸(果膠類)15.7%，中性非淀粉多糖29.1%，纖維素19.2%［2］。多糖除具有增稠性、膠凝性、乳化性等良好的功能性質(zhì)［3］，還具有多種生理功能，對肥胖病、糖尿病、心血管病、腸道癌癥等疾病有預(yù)防和抑制作用，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工、紡織等行業(yè)［4-6］。目前我國國內(nèi)各甜菜糖廠仍以傳統(tǒng)方法來處理甜菜粕，主要將甜菜粕經(jīng)過干燥壓榨成小顆粒狀作為牲畜的粗飼料銷售，產(chǎn)品的附加值較低。甜菜渣中有豐富的果膠等非淀粉多糖，是較為理想的多糖生產(chǎn)原料。

常用的甜菜多糖提取方法有很多種，如水提法，酸法、堿法、酶法、超聲法，微波輔助法等［7-10］。水提法是提取多糖的傳統(tǒng)方法，雖然設(shè)備簡單，容易操作，適用范圍廣泛，但多糖的得率低，提取時間長。木質(zhì)素是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的成分之一，具有使細(xì)胞相連的作用。由于有3%左右的木質(zhì)素與甜菜細(xì)胞壁多糖緊密結(jié)合［1］，常壓水提法難以破壞木質(zhì)素的骨架結(jié)構(gòu)，影響多糖的提取。高壓作用可以破壞木質(zhì)素與纖維素、半纖維素、果膠形成骨架結(jié)構(gòu)，使甜菜粕中的多糖更易于溶出。

本文對甜菜粕多糖提取工藝條件進(jìn)行研究，確定高壓法提取甜菜粕多糖的最佳工藝條件，并對甜菜廢粕粗多糖體外抗氧化進(jìn)行了研究。

1 試劑與儀器

1.1 主要試劑

甜菜粕，博城北方糖業(yè)股份有限公司;半乳糖醛酸(生化試劑)，沃凱國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;系列標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖，北京拜爾迪生物公司;阿魏酸(色譜純)，上海生工生物工程(上海)有限公司;其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

BFM-6BI型貝利微粉機(jī)，濟(jì)南倍力粉技術(shù)工程有限公司;LDZM-40KCS不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，上海申安器械廠;TDL-5-A臺式離心機(jī)，上海安亭有限公司;722S可見分光亮度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;N2000液相色譜儀，戴安中國有限公司;Heal Force超純水器，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 總多糖測定及其得率計(jì)算

采用苯酚-硫酸法［13］測定多糖。

采用間羥基聯(lián)苯法［14］測定酸性糖。

總多糖計(jì)算:通常糖醛酸含量較低的多糖(中性多糖)樣品采用苯酚-硫酸法即可得到總糖含量。而對于糖醛酸含量較高的樣品，糖醛酸在苯酚試劑中雖然有顯色，但微弱，且在490nm也不是最大吸收，因此無法準(zhǔn)確反映總糖的實(shí)際含量。由于采用間羥基聯(lián)苯法測糖醛酸含量不受中性糖的影響，首先測定糖醛酸含量，然后通過糖醛酸干擾回歸方程，計(jì)算糖醛酸對測定中性糖含量時的干擾值，將苯酚-硫酸法測定的多糖OD值減去糖醛酸干擾值，再通過回歸方程求得的糖含量即為樣品的多糖(中性糖)含量，與糖醛酸含量之和即可真實(shí)反映樣品的總多糖含量［22］。

其中:c，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的葡萄糖或半乳糖醛酸濃度，μg/mL;N，樣品稀釋倍數(shù);V，原樣加水體積，mL;m，樣品質(zhì)量，g。

總多糖得率的計(jì)算:

多糖得率/%=［提取總多糖質(zhì)量(g)/甜菜粕質(zhì)量(g)］×100

2.2 蛋白質(zhì)含量測定

采用Folin-酚法［15］測定粗多糖中蛋白質(zhì)的含量;

2.3 阿魏酸含量測定

(1)游離阿魏酸測定:經(jīng)冷凍干燥后的樣品配制成10 mg/mL的溶液，0.45 μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC分析。色譜條件:色譜柱為SunFireTMC185 μm(4.6 mm×150 mm Column)，柱溫25℃，流動相為V(甲醇)∶V(1% 乙酸)=40∶60，流速為 1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，UV檢測器，檢測波長320 nm。

(2)結(jié)合阿魏酸測定:將樣液與0.5 mol/L的NaOH溶液按體積比1∶1混勻后，在暗處室溫下反應(yīng)24 h，加入與樣液相同體積的0.5 mol/L的H3PO4終止反應(yīng)。樣液過0.45 μm濾膜后進(jìn)行HPLC分析。

2.4 多糖相對分子質(zhì)量分布測定

采用高效液相色譜法測定甜菜粕多糖的相對分子質(zhì)量分布。

色譜條件為:色譜柱:TSK-GEL G-6000PW xL column(7.8 mm×300 mm)與TSK-GEL G-3000PW xL column(7.8 mm×300 mm)串聯(lián)，泵:戴安N2000液相泵，檢測器:示差檢測器，柱溫為35℃，以純水為流動相，流速為0.6 mL/min。

首先將相對分子質(zhì)量分別為4 000，20 000，50 000，100 000，1 000 000和2 000 000的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖相繼進(jìn)樣，HPLC記錄各標(biāo)準(zhǔn)樣的保留時間，以保留時間為橫坐標(biāo)，LgMr為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程，然后將制得的粗糖樣配制成5 mg/mL，過0.45 μm膜，進(jìn)樣量為20 μL，根據(jù)所得的保留時間，通過上述回歸方程計(jì)算出甜菜粕多糖的不同組分的相對分子質(zhì)量分布。

2.5 多糖的體外抗氧化活性的測定

對DPPH自由基清除能力:采用比色法［17］測定。

對羥自由基清除能力:采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法［18］測定。

還原能力:采用鐵氰化鉀法［19］測定。

配制不同濃度的樣品溶液，以Vc為對照，對高溫高壓法提取的甜菜粕粗多糖進(jìn)行體外抗氧化活性的測定。

2.6 工藝流程

甜菜粕→粉碎(過60目篩)→ 高溫高壓提取→冷卻，離心(5 000 r/min，10 min)→上清液，過濾→濾液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮10倍→1∶4醇沉，靜置1 h→離心(5 000 r/min，10 min)，沉淀冷凍干燥→甜菜粕粗多糖

2.7 高溫高壓法提取甜菜廢粕中多糖的方法

取一定量甜菜廢粕粉，提取劑水按一定配比加入500 mL錐形瓶中，搖勻。用紗布封住錐形瓶口，放入不銹鋼壓力蒸汽滅菌器中。在設(shè)定的溫度、時間下提取菜廢粕多糖。冷卻，離心(5 000 r/min，10 min)，按濾液和乙醇1∶4的體積比加入無水乙醇，醇沉1 h后，離心(5 000 r/min，10 min)，棄去上清液，所得沉淀即為粗多糖。

2.8 高溫高壓法提取甜菜廢粕中多糖條件的優(yōu)化

以多糖得率作為衡量指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究料液比、時間、溫度3個因素對多糖得率的影響，確定最優(yōu)提取工藝條件。

2.9 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié)果與分析

3.1 固液比對甜菜粕多糖得率的影響

分別按固液比(g∶mL)為1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35加入甜菜粕和水，在121℃下提取3 h。測定多糖含量，計(jì)算得率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

由圖1可知，隨著固液比升高多糖得率先降低后上升，當(dāng)液料比為1∶30時后多糖得率最高。經(jīng)單因素方差分析，固液比對多糖提取率影響顯著(P＜0.05)。因此，初步選擇固液比為1∶30。

圖1 固液比對甜菜粕多糖得率的影響Fig.1 Effects of the ratio of solid on polysaccharides yield

3.2 時間對甜菜粕多糖得率的影響

按液料比為1∶30(g∶mL)加入甜菜粕和水，在121 ℃下分別提取 1，1.5，2，2.5，3，3.5，4 h。測定多糖含量，計(jì)算得率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

由圖2可知，提取時間從1 h增加到3 h時，多糖得率隨時間的增加而提高;當(dāng)提取時間進(jìn)一步增加至4 h時，提取率下降至17.81%，可能是因?yàn)樘崛〕龅亩嗵且驗(yàn)槟承┳饔卯a(chǎn)生降解，導(dǎo)致多糖提取率降低。經(jīng)單因素方差分析，提取時間量對多糖提取率影響顯著(P＜0.05)。在較高壓力作用下，細(xì)胞內(nèi)容物與進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的溶劑接觸，經(jīng)過一段時間，有效成分溶于這些溶劑中，有效成分的溶解平衡在3 h左右即可完成。初步選定提取時間為3 h。

圖2 時間對甜菜粕多糖得率的影響Fig.2 Effects of time on polysaccharides yield

3.3 溫度對甜菜粕多糖得率的影響

按液料比為1∶30加入甜菜粕和水，分別在100，105，110，115，121，124 ℃條件下提取 3 h。測定多糖含量，計(jì)算得率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 溫度對甜菜粕總多糖得率的影響Fig.3 Effects of temperature on polysaccharides yield

由圖3可知，當(dāng)溫度從100℃增加到121℃時，多糖得率隨著溫度的升高而增加，達(dá)到最高值;當(dāng)溫度超過121℃后，多糖得率下降。經(jīng)單因素方差分析，提取溫度對多糖提取率影響顯著(P＜0.05)。初步確定提取溫度為121℃。

3.4 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

為了優(yōu)化高溫高壓法提取甜菜廢粕中多糖的工藝條件，在以上單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)之上采用三因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，以確定最佳提取工藝條件。選用因素及水平見表1。正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表1 L9(34)正交因素水平表Table 1 Factors and levels of L9(34)orthogonal

由表2可知，按照極差大小，三因素中影響多糖得率的主次順序?yàn)锳＞C＞B，即時間＞固液比＞溫度。由表3方差分析可知，因素A顯著(P＜0.05)，B，C(P＞0.05)不顯著。最優(yōu)組合為A3B1C2，即時間4h，溫度115℃，固液比1∶30。經(jīng)驗(yàn)證該條件下所得多糖的提取率達(dá)23.89%。故經(jīng)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件確定最佳工藝條件為:時間4 h，溫度115℃，固液比1∶30。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test on extraction conditions

表3 方差分析Table 3 Orthogonal test analysis of variance table

3.5 甜菜粕多糖的化學(xué)組成分析

從表4可以看出，高壓法提取的甜菜粕粗多糖主要含有中性糖和酸性糖，而酸性糖含量略高于中性糖，表明該粗多糖為弱酸性多糖，同時還含有少量的阿魏酸，蛋白質(zhì)。

表4 甜菜粕多糖的主要化學(xué)組成Table 4 The majorcomponets of polysaccharides

3.6 甜菜粕多糖的相對分子質(zhì)量分布測定

葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品在分子質(zhì)量為4～2 000 kDa，LgMw-tR呈較好的線性關(guān)系，線性回歸方程為:y=-0.331 2x+14.367，R2=0.988 5。甜菜粕粗多糖和酸法提取的甜菜粕粗多糖［22］相對分子質(zhì)量分布測定結(jié)果見圖4。

圖4 多糖的相對分子質(zhì)量分布Fig.4 The molecular weight of polysaccharides

圖4-(a)為高溫高壓法提取甜菜粕粗多糖的分子質(zhì)量分布。從左至右各部分分子質(zhì)量約為337 224.41、33 484.53 及0.74 kDa

圖4-(b)為酸法提取的甜菜粕粗多糖的分子質(zhì)量分布。從左至右各部分分子質(zhì)量約為21 254.31及21.55 kDa

根據(jù)回歸方程計(jì)算出高溫高壓法提取的甜菜粕多糖的主要是相對分子質(zhì)量為337 224.41、33 484.53 kDa(二者之和占多糖的比例為96.68%)和0.74 kDa(占多糖比例3.32%)。酸法提取的甜菜粕多糖的相對分子質(zhì)量為21 254.31 kDa(占多糖比例65.71%)和21.55 kDa(占多糖比例34.29%)。高溫高壓法提取的甜菜粕多糖分子質(zhì)量大于酸法提取的甜菜粕多糖分子量，可能原因是酸法提取的甜菜粕多糖在酸性條件下發(fā)生分解，使分子質(zhì)量減小。

3.7 高溫高壓法提取甜菜粕粗多糖的體外抗氧化活性測定

甜菜粕粗多糖的體外抗氧化活性見圖5。

圖5 甜菜粕粗多糖的體外抗氧化活性Fig.5 The antioxidant activity of polysaccharide

以Vc為對照，比較高溫高壓法提取的甜菜粕粗多糖的體外抗氧化活性，結(jié)果分析見表5。

表5 甜菜粕粗多糖的體外抗氧化活性測定結(jié)果Table 5 Results ofthe antioxidant activity of polysaccharide

由圖5和表5可知，甜菜粕粗多糖對DPPH、羥自由基和還原能力都有一定的清除作用，并呈現(xiàn)良好的劑量依存關(guān)系。其中對DPPH清除能力最強(qiáng)，IC50=601.06 μg/mL，這可能是因?yàn)槎嗵侵泻?.82%的阿魏酸，使其具有清除自由基的能力。但甜菜粕粗多糖對DPPH、羥自由基和還原能力的清除能力低于Vc。

4 結(jié)論

高溫高壓法提取甜菜粕多糖的最佳工藝條件為:固液比1∶30(g∶mL)，時間 4 h，溫度 115 ℃，該條件下，多糖得率為23.89%。高溫高壓法提取甜菜粕粗多糖對DPPH、羥自由基和還原能力都有一定的清除作用，并呈現(xiàn)良好的劑量依存關(guān)系。其中對DPPH清除能力最強(qiáng)，IC50=601.06 μg/mL。多糖含有30.54%的中性糖55.47%糖醛酸和0.82%的阿魏酸及少量的蛋白質(zhì)。

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