大蒜不同極性萃取物的體外抗氧化活性*

邢利沙，陳海霞，王佳，王艷偉

(天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津市現(xiàn)代藥物傳遞及功能高效化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300072)

大蒜(Allium sativum L.)為百合科蔥屬植物，在我國南北方均有種植。大蒜鱗莖既是人們喜愛的調(diào)味品，又是常用的植物藥。大蒜的主要成分是水、蛋白質(zhì)和糖類，微量成分有脂類、酶類、肽類、氨基酸、苷類、維生素和微量元素等［1］。大蒜功能成分主要分為揮發(fā)性化合物和非揮發(fā)性化合物兩大類;揮發(fā)性化合物主要包括硫代亞磺酸酯類和其他脂溶性有機(jī)硫化物，非揮發(fā)性功能物質(zhì)主要包括水溶性有機(jī)硫化物、類固醇皂苷、甾體類、黃酮類、酚類等［2］。大蒜具有清熱解毒、殺菌消炎、預(yù)防和治療高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、提高機(jī)體免疫力和防癌抗癌等醫(yī)療保健作用［3］。大蒜藥物制劑在臨床上可用于治療心腦血管疾病、感染性疾病、治療口腔潰瘍、慢性結(jié)腸炎和脂肪肝等疾?。?］。目前，關(guān)于大蒜抗氧化活性的研究雖已有報(bào)道，但研究對象和評價(jià)方法不盡相同，而且關(guān)于大蒜不同極性萃取物體外抗氧化活性的研究鮮有報(bào)道。本研究中采用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇有機(jī)溶劑對大蒜的乙醇提取物進(jìn)行萃取，并分析了不同極性萃取物的體外抗氧化活性結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大蒜，購自天津大學(xué)附近的市場。

DPPH自由基，購自于Sigma公司，其余的試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

UV-9200紫外分光光度計(jì)(Rayleigh);電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠);FD-1A-50冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大蒜活性成分的提取

取去皮大蒜200 g，洗凈冷凍干燥得到脫水大蒜60.43 g，按1∶7(g∶mL)的比例加入體積分?jǐn)?shù) 80% 乙醇回流提取2 h，過濾濾渣同法提取2次。合并3次濾液，于45℃下減壓濃縮回收溶劑，得到大蒜粗提物(Crude-Extract)11.67 g。

將大蒜乙醇粗提物混懸于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別減壓回收溶劑，真空冷凍干燥得石油醚萃取物(PE-F):0.17 g，乙酸乙酯萃取物(EA-F):0.14 g，正丁醇萃取物(n-Bu-F):4.75 g，水萃取物(W-F):6.23 g。

1.3.2 多酚含量的測定

采用福林-酚比色法測定粗提物和不同極性萃取物的總多酚含量［5］。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=0.004A760+0.001(R2=0.996)。向反應(yīng)體系中加入粗提物及不同極性萃取物的樣品溶液，在760 nm波長下測定其吸收值A(chǔ)，通過多酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中多酚含量。

1.3.3 抗氧化活性測定方法

1.3.3.1 大蒜不同極性萃取物對DPPH自由基清除作用

大蒜不同極性萃取物清除DPPH自由基的活性按照文獻(xiàn)［6］的方法進(jìn)行測定。在517 nm下測定不同樣品溶液的吸光度A，不加樣品的反應(yīng)體系作為對照，每個(gè)樣品測定5個(gè)不同質(zhì)量濃度。樣品對DPPH自由基清除率的計(jì)算公式為:

1.3.3.2 大蒜不同極性萃取物的還原力測定

配制不同濃度的樣品溶液，按照文獻(xiàn)［7］的測定方法測定還原力活性。向0.1 mL不同濃度的樣品溶液中加入0.2 mol/L pH值為6.6的磷酸鹽緩沖液0.7 mL和30 mmol/L的K3Fe(CN)6溶液2 mL，50℃水浴20 min后加入10%三氯乙酸2 mL，混勻后靜置10 min。取上述溶液的上清液1 mL加入FeCl33 mL靜置10 min，700 nm波長測吸光度A，吸光值越大則還原力越強(qiáng)。

1.3.3.4 大蒜不同極性萃取物對Fe2+-Vc誘導(dǎo)小鼠肝脂質(zhì)過氧化抑制活性

［8］的測定方法，小鼠禁食12 h后，脫頸椎處死，迅速取出肝臟，在4℃下加入30倍體積生理鹽水制成肝勻漿。向不同濃度的0.1 mL樣品溶液中分別加入 100 μ mol/L 的 Vc、10 μ mol/L 的 FeSO4溶液各0.25 mL，pH為7.4、0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液0.9 mL，肝勻漿0.5 mL，以不加Vc和FeSO4的反應(yīng)體系作為對照。將上述反應(yīng)體系在37℃中保溫30 min，加入20%的三氯乙酸(TCA)1 mL終止反應(yīng)，再加入顯色劑0.67%的硫代巴比妥酸(TBA)1 mL，充分混勻后，100℃沸水浴顯色反應(yīng)，冰水浴終止顯色反應(yīng)，3 800 r/min離心15 min，取上清液，在532 nm波長測吸光度A。每個(gè)樣品平行操作3次取平均值。樣品對肝脂質(zhì)過氧化抑制率的計(jì)算公式為:

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜不同極性萃取物得率及多酚含量

大蒜不同極性萃取物經(jīng)過減壓濃縮，冷凍干燥，得到不同極性部位的樣品，其得率和多酚含量見表1。由表1可知，由于溶劑極性不同對萃取產(chǎn)物的得率，萃取產(chǎn)物的成分組成有較大的影響，其中正丁醇萃取物得率和多酚的含量分別為(7.861±0.541)%和(3.784±0.023)%。

表1 不同極性部位的大蒜提取物得率和多酚含量Table 1 Yields and content of polyphenol of different fractions of garlic

2.2 大蒜不同極性萃取物對DPPH自由基的清除作用

DPPH是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，已經(jīng)被廣泛用來測定不同植物的抗氧化活性，因此可以通過測定樣品對DPPH自由基的清除能力來評價(jià)抗氧化劑的性能［9-10］。由圖1可以得出，大蒜不同極性萃取物對DPPH自由基均有一定的清除能力，其清除率與不同極性萃取物樣品的質(zhì)量濃度呈現(xiàn)良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。在檢測的濃度內(nèi)(0.17～0.83 mg/mL):乙醇粗提物、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取物對DPPH的清除能力的線性相關(guān)系數(shù) R2分別為0.964、0.989、0.971、0.975和0.946。正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物對DPPH自由基的半數(shù)清除率(IC50)分別為0.46、0.50和0.79 mg/mL;其清除 DPPH自由基活性均比粗提物的活性好，且有顯著性差異(P＜0.01)。多酚含量較高的正丁醇萃取物比其他各層萃取物清除DPPH自由基能力強(qiáng)。

圖1 大蒜水提取物對DPPH自由基的清除作用(n=3)Fig.1 Scavenging activity against DPPH free radicals of different extracts from garlic(n=3)

2.3 大蒜不同極性萃取物的還原力測定

抗氧化劑的還原力與其抗氧化性之間存在聯(lián)系，還原能力的高低可以間接反映抗氧化能力的強(qiáng)弱，因此還原力檢測被廣泛用來檢測植物藥抗氧化活性［11-12］。由圖2可知大蒜粗提物及其不同極性萃取物均有一定的還原能力，還原能力強(qiáng)弱次序?yàn)?正丁醇萃取物＞乙酸乙酯萃取物＞石油醚萃取物＞粗提物＞水萃取物。正丁醇萃取物的還原力明顯優(yōu)于粗提物和其它極性萃取物的活性，在顯著性水平檢驗(yàn)中正丁醇萃取物的還原力活性與其他樣品之間均存在顯著性差異(P＜0.01)。在0～0.13 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，正丁醇萃取物的還原力活性具有較好的線性濃度依賴關(guān)系(R2=0.996)。由試驗(yàn)結(jié)果可以得出，大蒜的粗提物通過不同極性溶劑分級后抗氧化活性成分多酚在正丁醇萃取物得到富集，這可能是正丁醇萃取物還原力活性明顯優(yōu)于其它樣品的原因之一。

圖2 大蒜提取物還原力活性測定結(jié)果(n=3)Fig.2 Reducing power of different extracts from garlic(n=3)

2.4 大蒜不同極性萃取物對Fe2+-Vc誘導(dǎo)的小鼠肝脂質(zhì)過氧化抑制測定

脂質(zhì)過氧化是細(xì)胞膜上的多元不飽和脂肪酸的氧化降解過程。丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化的中間產(chǎn)物之一，其含量的高低可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度。抗氧化劑通過抑制脂質(zhì)過氧化的發(fā)生減少M(fèi)DA的生成。通過測定MDA的吸光度可以反映脂質(zhì)過氧化抑制活性的大小，吸光度越小抗氧化劑對脂質(zhì)過氧化的抑制作用就越強(qiáng)［13-14］。從圖3可以看出，在檢測的濃度范圍內(nèi)(0.125～0.625 mg/mL)不同的樣品對脂質(zhì)過氧化的抑制能力隨濃度的增大呈逐步上升的趨勢。石油醚萃取物，乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物均有較好的肝脂質(zhì)過氧化抑制活性且石油醚萃取物的抑制活性優(yōu)于其他萃取物的活性。石油醚萃取物，乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的半數(shù)抑制濃度分別為0.20，0.39和0.36 mg/mL，在測定的濃度范圍內(nèi)粗提物和水萃取物部分均未得到半數(shù)抑制濃度。該測定結(jié)果與清除DPPH自由基和還原力活性的結(jié)果不同，可能是由于石油醚提取物的極性較小，更容易進(jìn)入細(xì)胞膜進(jìn)而抑制細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸的氧化降解，降低了MDA的生成量，較其他萃取物更好地抑制了肝脂質(zhì)過氧化。

圖3 大蒜提取物對Fe2+-Vc誘導(dǎo)小鼠肝脂質(zhì)過氧化的抑制(n=3)Fig.3 Inhibition effect of different extracts from garlic on liver lipid peroxidation(n=3)

3 結(jié)論

采用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇回流提取、梯度萃取得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物。通過DPPH自由基清除活性，還原力和肝脂質(zhì)過氧化抑制活性評價(jià)分析了粗提物和不同極性萃取物的體外抗氧化活性。結(jié)果表明，大蒜粗提物和不同極性萃取物均有抗氧化活性，其抗氧化活性大小與樣品具有較好的劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系。在不同抗氧化體系中，大蒜不同極性萃取物的抗氧化活性強(qiáng)弱不同，其中清除DPPH自由基和還原力的強(qiáng)弱一致大小次序均為:正丁醇萃取物＞乙酸乙酯萃取物＞石油醚萃取物＞粗提物＞水萃取物。肝脂質(zhì)過氧化抑制活性的強(qiáng)弱順序?yàn)?石油醚萃取物＞正丁醇萃取物＞乙酸乙酯萃取物＞粗提物＞水萃取物。在清除DPPH自由基和還原力的抗氧化活性測定中，得率和多酚含量較高的正丁醇萃取物具有較好的抗氧化活性。石油醚萃取物具有較好的肝脂質(zhì)過氧化抑制活性，分析原因可能是由于采用的抗氧化體系不同，不同極性萃取物抗氧化成分的種類和結(jié)構(gòu)有所差異。結(jié)果表明，與大蒜的乙醇粗提物和其他萃取物相比，正丁醇萃取物在清除DPPH自由基和還原力體外抗氧化模型中表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，在肝脂質(zhì)過氧化抑制活性模型中也表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，是大蒜的活性部位，其抗氧化活性與多酚的含量呈正相關(guān)的關(guān)系。綜上所述，得率和多酚含量較高的正丁醇萃取物具有較好體外抗氧化活性，作為天然抗氧化劑的開發(fā)研究具有開發(fā)利用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

［1］ 田莉，楊秀偉，陶海燕.大蒜化學(xué)成分的氣-質(zhì)聯(lián)用分析［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006，17(5):533-538.

［2］ 閆淼淼，許真，徐蟬，等.大蒜功能成分研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2010，31(5):312-318.

［3］ Amagase H.Clarifying the real bioactive constituents of garlic［J］.The Journal of Nutrition，2006，136(3):716S-725S.

［4］ 楊德明.大蒜的藥理研究概況［J］.時(shí)珍國藥研究，1991，2(4):185-187.

［5］ 王畢妮，曹煒，高慧，等.紅棗醬的體外抗氧化作用［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(7):128-131.

［6］ Kallel F，Driss D，Chaari F，et al.Garlic(Allium sativum L.)husk waste as a potential source of phenolic compounds:Influence of extracting solvents on its antimicrobial and antioxidant properties［J］.Industrial Crops and Products，2014，62:34-41.

［7］ TIAN J，CHEN H，CHEN，S，et al.Comparative studies on the constituents，antioxidant and anticancer activities of extracts from different varieties of corn silk［J］.Food ＆Function，2013，4(10):1 526-1 534.

［8］ MA L，CHEN H，ZHANG Y，et al.Chemical modification and antioxidant activities of polysaccharide from mushroom Inonotus obliquus ［J］.Carbohydrate Polymers，2012，89(2):371-378.

［9］ Kiselova Y，Ivanova D，Chervenkov T，et al.Correlation between the in vitro antioxidant activity and polyphenol content of aqueous extracts from Bulgarian herbs［J］.Phytotherapy Research，2006，20(11):961-965.

［10］ Matth?us B.Antioxidant activity of extracts obtained from residues of different oilseeds［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50(12):3 444-3 452.

［11］ Custódio L，F(xiàn)ernandes E，Escapa A L，et al.Antioxidant and cytotoxic activities of carob tree fruit pulps are strongly influenced by gender and cultivar［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59(13):7 005-7 012.

［12］ XING R，YU H，LIU S，et al.Antioxidant activity of differently regioselective chitosan sulfates in vitro［J］.Bioorganic ＆ Medicinal Chemistry，2005，13(4):1 387-1 392.

［13］ Ferreira I C F R，Barros L，Soares M E，et al.Antioxidant activity and phenolic contents of Olea europaea L.leaves sprayed with different copper formulations ［J］.Food Chemistry，2007，103(1):188-195.

［14］ LI X L，ZHOU A G，HAN Y.Anti-oxidation and anti-microorganism activities of purification polysaccharide from Lygodium japonicum in vitro［J］.Carbohydrate Polymers，2006，66(1):34-42.