重組木聚糖酶酶解玉米芯制備低聚木糖*

楊然，朱培華，姚君，李秀婷

1(北京工商大學(xué)食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京，10048)

2(北京工商大學(xué)食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京，100048)

3(北京工商大學(xué)北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100048)

低聚木糖又稱木寡糖，由2～7個(gè)木糖以β-1，4-糖苷鍵連接而成，以木二糖、木三糖為主，具有顯著的雙歧桿菌增殖能力，還具有不被消化性、無齲齒性及促進(jìn)人體對(duì)鈣的吸收等特性［1］。在我國(guó)，玉米作為重要的糧食經(jīng)濟(jì)作物，每年會(huì)產(chǎn)生大量的農(nóng)業(yè)廢棄物玉米芯，而玉米芯中木聚糖的含量高達(dá)35% ～40%［2］。采用適宜的提取方式獲得豐富的玉米芯木聚糖資源，并應(yīng)用酶解技術(shù)制備功能性低聚木糖，勢(shì)必可以解決環(huán)境問題，同時(shí)變廢為寶，創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)附加值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料、菌種與試劑

玉米芯原料，山東龍力公司饋贈(zèng);重組木聚糖酶，實(shí)驗(yàn)室制備重組畢赤酵母GS115發(fā)酵所得;木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖標(biāo)品，購自Sigma公司;其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基:葡萄糖2%，胰蛋白胨2%，酵母提取物1%，瓊脂1.5%;BMGY培養(yǎng)基:胰蛋白胨2%，酵母提取物 1%，甘油 1%，YNB 1.34%，生物素0.05%，KH2PO41.2%，KH2PO40.3%;BMMY培養(yǎng)基:胰蛋白胨2%，酵母提取物1%，甲醇0.5%，YNB 1.34%，生物素 0.05%，KH2PO41.2%，KH2PO40.3%。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 木聚糖酶活力的測(cè)定

木聚糖酶活力的測(cè)定參照DNS法［3］。取0.1 mL適當(dāng)稀釋的酶溶液，加入到0.9 mL用0.05 mol/L、pH 4.8的醋酸緩沖液配制的10 g/L櫸木木聚糖底物溶液中，55℃反應(yīng)5 min，用DNS法測(cè)定釋放的還原糖量，利用木糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線。木聚糖酶活力單位定義為:在上述條件下，每分鐘水解木聚糖生成1 μmol還原糖所需要的酶量。

1.2.2 酶解還原糖含量的測(cè)定及組成分析

還原糖含量的測(cè)定采用DNS比色法［4］。分別取0.1 mL木聚糖酶水解液加入DNS試劑0.9 mL，沸水浴中煮沸5 min后顯色，迅速冷卻，用蒸餾水定容至刻度搖勻，540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以木糖為標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算水解液中還原糖含量。

酶解產(chǎn)物組成分析采用薄層層析法。展層劑:V(正丁醇)∶V(乙酸)∶V(高純水)=2∶1∶1，展層 1 次。顯色劑:V(甲醇)∶V(濃 H2SO4)=95∶5，130 ℃烘烤顯色，同時(shí)用木糖～木五糖作標(biāo)準(zhǔn)樣品。

1.2.3 玉米芯木聚糖含量的測(cè)定

本試驗(yàn)改進(jìn)Hashimoto等［5］用地衣酚-鹽酸法測(cè)定面粉中總戊聚糖含量的方法，用于玉米芯中木聚糖含量的測(cè)定。

稱取1.875 g FeCl3和0.5 g地衣酚，將兩者混合預(yù)溶于10 mL重蒸水中，后用30%HCl定容至250 mL備用。取0.5 g待測(cè)樣品于研缽中，加入72%的H2SO45 mL，研磨樣品1 h至樣品完全成均勻乳狀，將乳狀物轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中定容，充分混勻，濾紙過濾，上清液用地衣酚-鹽酸法測(cè)總糖含量(mg/L)。

1.3 玉米芯木聚糖的制備

1.3.1 堿法提取玉米芯木聚糖

稱取玉米芯100 g，按料液比1∶10添加去離子水1 000 mL，煮沸1 h，過濾，棄去上清液，以減少雜質(zhì)對(duì)木聚糖得率的影響。再按料液比為1∶10添加10%的NaOH溶液，煮沸2 h，過濾，棄去濾渣，濾液用HCl中和至pH 7，8 000 r/min離心處理15 min，所得沉淀經(jīng)多次洗滌即為玉米芯粗木聚糖，60℃烘干，待測(cè)得率。

1.3.2 蒸煮解法提取玉米芯木聚糖

稱取玉米芯100 g，按料液比1∶10添加濃度為0.1% 的H2SO4溶液1 000 mL，60℃水浴12 h，過濾，棄去上清液，加水1 000 mL，121℃密封蒸煮2 h，過濾，棄去濾渣，調(diào)節(jié)pH值至7，醇沉，8 000 r/min離心處理15 min，取固體，透析，60℃烘干，待測(cè)得率。

1.4 酶解法制備玉米芯低聚木糖

1.4.1 單因素試驗(yàn)

利用重組畢赤酵母GS115發(fā)酵制備木聚糖酶XynA，并對(duì)堿法提取的玉米芯木聚糖進(jìn)行酶解以制備低聚木糖。分別考察不同加酶量(5、10、15、20、25 U/mL;其他酶解條件為底物濃度2%，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間 4 h);不同底物濃度(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%);不同酶解時(shí)間(0.5、1、2、4、6、8 h);不同酶解溫度(40、45、50、55、60 ℃)等條件對(duì)還原糖得率的影響。

1.4.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)確定影響酶解的關(guān)鍵因素，利用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)組合試驗(yàn)，并采用 Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)3因素3水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，以確定最佳酶解條件。

1.5 玉米芯木聚糖及低聚木糖制備得率的計(jì)算方法

玉米芯木聚糖得率計(jì)算公式:

玉米芯低聚木糖(還原糖)得率計(jì)算公式:

式中，Xm:玉米芯木聚糖得率，%;XOs:玉米芯低聚木糖(還原糖)得率，%;m:玉米芯粗木聚糖質(zhì)量，g;M:玉米芯的質(zhì)量，g;Y:玉米芯中木聚糖含量;Y`:玉米芯粗木聚糖含量;c:酶解液還原糖濃度，g/mL;V:酶解液體積，mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米芯木聚糖的提取

低聚木糖的生產(chǎn)分為木聚糖的提取與水解，要獲得低聚木二糖、木三糖較高的低聚木糖，木聚糖的提取十分關(guān)鍵［6］。根據(jù)半纖維素提取所使用的溶劑的不同，提取方法可歸納為三大類，即酸水解、堿水解和熱水解法［7］。其基本原理都是破壞半纖維素與纖維素、木質(zhì)素及其他成分間的結(jié)合鍵，從而使半纖維素游離出來［8］。本文分別考察了蒸煮法及堿提法對(duì)玉米芯粗木聚糖提取效果的影響，結(jié)果如圖1所示。采用堿提法提取得到的玉米芯粗木聚糖得率為36.7%，此試驗(yàn)結(jié)果高于邵佩蘭等人［9］采用同樣方法提取的玉米芯粗木聚糖得率。而另一種木聚糖提取方法-蒸煮法，相對(duì)于堿提法對(duì)環(huán)境表現(xiàn)溫和，但所得玉米芯粗木聚糖得率較低。

圖1 不同提取方法對(duì)玉米芯粗木聚糖得率的影響Fig.1 The effect of different extraction methods on the yield of corn cob xylan

為進(jìn)一步確定2種提取方法所得木聚糖原料對(duì)酶解制備低聚木糖的影響，將2種方法所得粗木聚糖經(jīng)木聚糖酶酶解，產(chǎn)物經(jīng)薄層層析展開，結(jié)果如圖2所示。蒸煮法和堿提法所得木聚糖原料經(jīng)木聚糖酶酶解后均可得到以木二糖、木三糖、木四糖及木五糖為主要產(chǎn)物的低聚木糖。然而，蒸煮法所得木聚糖在酶解過程中產(chǎn)生了部分木糖和糖醛類物質(zhì)［10］，這些產(chǎn)物的生成不利于低聚木糖的生產(chǎn)制備及分離純化。因此，后續(xù)試驗(yàn)以堿提法獲得的玉米芯粗木聚糖為底物制備低聚木糖。

圖2 不同方法提取玉米芯木聚糖酶解產(chǎn)物TLC分析圖Fig.2 TLC analysis of hydrolyzate from corn cob xylan extraction by different menthods

2.2 酶解堿法提取玉米芯粗木聚糖制備低聚木糖

2.2.1 加酶量對(duì)還原糖得率的影響

本試驗(yàn)選擇重組畢赤酵母GS115發(fā)酵制備的重組木聚糖酶XynA為酶解實(shí)驗(yàn)用酶。該重組菌株經(jīng)BMGY培養(yǎng)基富集培養(yǎng)48 h后，無菌重懸至BMMY培養(yǎng)基中。每24 h添加0.5%甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)，至216 h后得到酶活力約為2 235 U/mL的木聚糖酶XynA。經(jīng)測(cè)定，該重組木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為55℃，最適反應(yīng)pH值為4.8，有較好的溫度穩(wěn)定性及耐酸性，適宜低聚木糖的生產(chǎn)應(yīng)用。分別選擇5、10、15、20、25 U/mL的木聚糖酶添加到酶解試驗(yàn)體系中，以確定酶解法制備玉米芯低聚木糖的最適加酶量，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。當(dāng)加酶量在5～15 U/mL，玉米芯木聚糖的還原糖得率增幅緩慢，繼續(xù)提高加酶量至20 U/mL時(shí)，還原糖得率最高為13.5%，繼續(xù)增加加酶量，還原糖得率沒有明顯提高。

圖3 加酶量對(duì)還原糖得率的影響Fig.3 The effects of the dosage of XynA on the yield of reducing suger

2.2.2 底物濃度對(duì)還原糖得率的影響

底物濃度對(duì)還原糖得率的影響結(jié)果如圖4所示，當(dāng)玉米芯粗木聚糖濃度為1%時(shí)，酶解所得還原糖得率最高，而繼續(xù)增加底物濃度還原糖的得率明顯降低。張金永等人同樣以玉米芯為原料酶法制備低聚木糖，最適底物濃度為3%［11］。實(shí)際生產(chǎn)中，較高的底物濃度有利于生產(chǎn)成本的降低，然而底物濃度的提高往往會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品得率的下降。在高底物濃度環(huán)境下，體系黏度較大，影響了酶、底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散以及酶與底物的接觸，從而降低了木聚糖酶的酶解效率［12］。

圖4 底物濃度對(duì)還原糖得率的影響Fig.4 The effects of the substrate concentration on the yield of reducing suger

2.2.3 酶解溫度對(duì)還原糖得率的影響

酶解溫度對(duì)還原糖得率的影響如圖5所示。隨著酶解溫度的升高，還原糖得率直線上升，至50℃時(shí)達(dá)到最大值約33%;繼續(xù)升高酶解溫度，還原糖得率反而降低，60℃時(shí)得率僅為峰值的41.2%。本試驗(yàn)所用木聚糖酶為重組酶，前期試驗(yàn)結(jié)果顯示該酶的最適反應(yīng)溫度為55℃，在50℃左右該酶能保持良好的熱穩(wěn)定性和水解效果。韓玉潔等人研究以小麥麩皮為底物制備低聚木糖，其研究結(jié)果表明該酶解反應(yīng)的最適溫度為40℃［13］。一般來說，反應(yīng)溫度對(duì)酶解效果的影響是多方面的，在一定范圍內(nèi)，升高溫度可以加快酶-底物中間體分解轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的速度，然而溫度過高會(huì)降低酶的穩(wěn)定性，使其失去活性，最終影響酶的酶解效果［14］。

圖5 酶解溫度對(duì)還原糖得率的影響Fig.5 The effects of temperature on the yield of reducing suger

2.2.4 酶解時(shí)間對(duì)還原糖得率的影響

酶解時(shí)間對(duì)還原糖得率的影響如圖6所示。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)還原糖得率逐漸上升。酶解0.5 h到4 h階段還原糖得率上升速度較快(增長(zhǎng)了3.3倍);4 h后反應(yīng)體系中還原糖的濃度基本保持不變。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，木聚糖酶的活性逐漸降低，酶解效率下降;另一方面，底物的減少和酶解產(chǎn)物引發(fā)的反饋抑制效應(yīng)進(jìn)一步影響了木聚糖酶的酶解效力［15］。

圖6 酶解時(shí)間對(duì)還原糖得率的影響Fig.6 The effects of hydrolysis time on the yield of reducing suger

2.2.5 酶解條件的響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)Design Expert 8.0.1的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，依據(jù)酶解條件單因素試驗(yàn)結(jié)果選擇對(duì)酶解影響最為顯著的3個(gè)因素，即木聚糖底物濃度(A)、酶解溫度(B)和酶解時(shí)間(C)，以酶解產(chǎn)生還原糖得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，經(jīng)軟件設(shè)計(jì)共有17組組合試驗(yàn)，按各個(gè)組合試驗(yàn)因素要求完成了玉米芯木聚糖的酶解試驗(yàn)，各組合試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Design and results of Box-Behnken experiment

表2是本試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂尚哦冉y(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，經(jīng)分析可知預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)(Pred-R-Squared)0.912 6與修正相關(guān)系數(shù)(Adj.R-square)0.971 9數(shù)值相近，說明此模型可信度較高。當(dāng)噪音值大于4時(shí)，說明響應(yīng)面模型擬合度理想，而本試驗(yàn)中噪音比數(shù)值為21.399，進(jìn)一步說明此模型可操作性強(qiáng)，可用此模型對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。

表2 模型可信度分析表Table 2 Analysis of model reliability

利用Design-Expert軟件對(duì)數(shù)據(jù)(表3)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，獲得還原糖得率對(duì)底物濃度、酶解溫度及酶解時(shí)間的二次多項(xiàng)回歸方程:還原糖得率=33.58-0.19 A-1.50B+1.19C+0.100 A B-0.98AC-0.80BC-1.60 A2-4.08 B2-2.85 C2

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Test and results of significance for simulated regression coefficient

在影響還原糖得率的因素中，一次項(xiàng)B、C及二次項(xiàng) AC、BC、A2、B2、C2即木聚糖底物濃度、酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)木聚糖酶解效率的影響都非常顯著。由此可知，各個(gè)具體試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的一次線性關(guān)系，而符合曲線規(guī)律，如回歸方程所示。方差試驗(yàn)結(jié)果分析中，失擬項(xiàng)F值為2.09，而P＞F值為0.244 9，說明本模型可操作性較強(qiáng)，不易引起系統(tǒng)誤差。

圖7為底物濃度與酶解溫度對(duì)還原糖得率的影響。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.5% ～1.1%，酶解溫度為45～51℃范圍時(shí)，兩者存在著顯著的增效作用，玉米芯還原糖的得率隨著底物濃度和酶解溫度的增加而增加;而隨著底物濃度和酶解時(shí)間的進(jìn)一步增加，還原糖的得率反而降低。分析響應(yīng)面曲面可知，底物濃度和酶解溫度對(duì)玉米芯還原糖得率的交互影響顯著，而溫度因素的曲面彎曲度較大，說明該因素對(duì)還原糖得率的影響更為顯著［17］。

圖7 底物濃度與酶解溫度對(duì)還原糖得率的影響Fig.7 The effect of substrate concentration and temperature on the yield of reducing suger

圖8為酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)玉米芯還原糖得率的影響。當(dāng)酶解溫度在50℃左右，酶解時(shí)間在4 h左右時(shí)，響應(yīng)面曲面出現(xiàn)峰值，說明酶解溫度和酶解時(shí)間兩因素對(duì)還原糖得率影響顯著，且二者呈現(xiàn)明顯的交互作用。

圖8 酶解溫度與酶解時(shí)間對(duì)還原糖得率的影響Fig.8 The effect of temperature and hydrolysis time on the yield of reducing suger

利用Design-Expert軟件優(yōu)化最佳酶解條件為木聚糖底物濃度0.9%、酶解溫度49℃、酶解時(shí)間4.5 h，在此條件下得到實(shí)際還原糖可達(dá)33.9%，較單因素試驗(yàn)結(jié)果提高了約1.1%。歐陽嘉等人研究了重組木聚糖酶C0602生產(chǎn)低聚木糖的制備工藝，還原糖產(chǎn)率為29.76%，低于本試驗(yàn)研究結(jié)果［18］。

2.3 酶解產(chǎn)物組成分析

功能性低聚木糖是由2～7個(gè)D-木糖以β-1，4-木糖苷鍵結(jié)合而成的，由于低聚合度的糖具有獨(dú)特的生理功能和良好的工藝性能，成為了低聚糖的主要功效成分，因此聚合度在2～4之間的低聚木糖在食品行業(yè)中的應(yīng)用較為廣泛［19］。本文按照優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件酶解堿法提取玉米芯木聚糖，采用TLC分析其酶解產(chǎn)物大致組成。分析結(jié)果如圖9所示，畢赤酵母所產(chǎn)重組木聚糖酶XynA酶解玉米芯木聚糖所得酶解產(chǎn)物主要為木二糖、木三糖，無木糖產(chǎn)生。酶解初始階段，隨著酶解時(shí)間的增加，木二糖、木三糖含量增加，且有少量木四糖、木五糖產(chǎn)生;8 h后木五糖及木四糖又逐漸酶解轉(zhuǎn)化為木三糖及木二糖。由此可見，利用重組木聚糖酶XynA酶解玉米芯木聚糖生產(chǎn)低聚木糖具有良好的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。近年來，利用木聚糖酶酶解木聚糖制備低聚木糖的研究越來越普遍。汪輝等人利用木聚糖酶酶解豆皮制備低聚木糖，通過離子色譜檢測(cè)酶解液中的糖分組成，發(fā)現(xiàn)酶解液中含有大量單糖［20］;朱浩擁等人采用響應(yīng)面法優(yōu)化玉米芯木聚糖酶解制備低聚木糖的酶解條件，并利用TLC法分析酶解液中產(chǎn)物組成主要為木二糖、木三糖及木四糖且以木二糖、木三糖含量為主［21］，與本試驗(yàn)結(jié)果分析基本一致。

圖9 堿法提取玉米芯木聚糖酶解產(chǎn)物TLC分析圖Fig.9 TLC analysis of hydrolyzate of corn cob xylan by recombinant xylanases from Pichia pastoris

3 結(jié)論

(1)本試驗(yàn)考察了蒸煮法和堿提法對(duì)玉米芯木聚糖得率的影響，試驗(yàn)結(jié)果顯示，以堿提法得到的木聚糖得率較高為36.7%，且分析二者酶解產(chǎn)物組成可知，堿提法所得木聚糖經(jīng)酶解制備獲得的低聚糖以木二糖-木五糖為主，無木糖及糖醛類物質(zhì)產(chǎn)生，適宜作為酶解底物制備低聚木糖。

(2)通過單因素、響應(yīng)面試驗(yàn)確定以堿提玉米芯木聚糖為原料制備低聚木糖的最佳條件:底物濃度0.9%，酶解溫度49℃，酶解時(shí)間4.5 h，在此條件下得到實(shí)際還原糖量可達(dá)33.9%。另外，對(duì)酶解液的成分進(jìn)行TLC分析，結(jié)果表明酶解堿提玉米芯木聚糖可產(chǎn)生以木二糖及木三糖為主要成分的低聚木糖溶液。

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