V1C定點(diǎn)突變木聚糖酶XynZF-2對(duì)酶熱穩(wěn)定性的影響*

李同彪，周晨妍，朱新術(shù)，王丹丹，2，陳亞文，謝晶晶

1(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)，453000)

2(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)，453000)

木聚糖是植物細(xì)胞組織中半纖維素的重要成分，是一種含量豐富的生物資源。然而在自然界中很難被降解利用，造成了大量生物資源的浪費(fèi)［1］。木聚糖酶(EC.3.2.1.8)是一類降解木聚糖的多功能酶類的總稱［2］，可以將木聚糖水解成低聚木糖、木糖等還原性糖［3］。木聚糖酶在自然界中含量豐富，許多真菌、植物組織、細(xì)菌都可產(chǎn)生木聚糖酶，近年來得到了人們的廣泛關(guān)注［4］。

同時(shí)，木聚糖酶也是一種重要的工業(yè)酶制劑，廣泛應(yīng)用于食品加工、紡織、紙漿漂白、釀造、飼料加工等多個(gè)領(lǐng)域［5］。但不同領(lǐng)域需要的木聚糖酶的特性不同，如紙漿漂白、飼料加工等都需要經(jīng)過高溫處理，而大多數(shù)木聚糖酶屬于中溫木聚糖酶，熱穩(wěn)定性較差，難以滿足工業(yè)的需求［6］。因此，提高木聚糖酶熱穩(wěn)定性已成為當(dāng)今人們廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)。高樹娟等［7］將源于米曲霉 Aspergillus oryzae的木聚糖酶AoXyn11A的N端替換成耐熱木聚糖酶EvXyn11TS的相應(yīng)片段，構(gòu)建重組木聚糖酶AEx11A，并在畢赤酵母GS115中表達(dá)，重組木聚糖酶熱穩(wěn)定性明顯提高。DING 等［8］對(duì) Streptomyces lividans的木聚糖酶XynA進(jìn)行了分子動(dòng)力學(xué)模擬，刪除XynA基因的N端，最適溫度下降了6℃，刪除XynA基因的C端，最適溫度增加了6℃。由此推測(cè)，木聚糖酶的N端和C端對(duì)其熱穩(wěn)定性均有影響。

本實(shí)驗(yàn)室已采用RT-PCR等技術(shù)，從黑曲霉XZ-3S中克隆出木聚糖酶基因xynZF-2，并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)［9］。本研究旨在保持木聚糖酶XynZF-2良好特性的基礎(chǔ)上，借助生物信息學(xué)分析，采用分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)木聚糖酶XynZF-2進(jìn)行定點(diǎn)突變，期望提高該酶的熱穩(wěn)定性，為其進(jìn)一步結(jié)構(gòu)與功能研究提供實(shí)驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種和質(zhì)粒:黑曲霉(Aspergillus niger)XZ-3S由本實(shí)驗(yàn)室保存;大腸桿菌JM109、BL21(DE3)、表達(dá)質(zhì)粒pET-28a均購自 Novagen公司。重組質(zhì)粒 pET-28a-xynZF-2由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存，TA克隆載體pMDTM18-T購自TaKaRa公司。

1.2 培養(yǎng)基、工具酶和主要試劑

培養(yǎng)基:大腸桿菌培養(yǎng)基LB。

工具酶:T4DNA Ligase、限制性內(nèi)切酶、DL1000 DNA Marker、IPTG以及 X-gal均購自 TaKaRa公司;蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購自碧云天生物技術(shù)有限公司;DNA片段回收試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司;DNA質(zhì)粒提取試劑盒購自Sangon公司;其他生化試劑主要是國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.3 同源序列比對(duì)以及同源建模

通過Blast比對(duì)同源序列，并在SWISS-MODEL上完成對(duì)XynZF-2V1C的建模［10］。

1.4 定點(diǎn)突變和重組質(zhì)粒pMDTM18-T-xynZF-2v1c構(gòu)建

以pET-28a-xynZF-2為模板，采用降落PCR法，反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)［9］，引物見表1，擴(kuò)增出突變基因v1c(圖1)，割膠回收。T4DNA Ligase連接膠回收產(chǎn)物與pMDTM18-T載體，16℃過夜。熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，藍(lán)白斑篩選陽性克隆，抽提重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR驗(yàn)證，送北京六合華大基因公司測(cè)序。

表1 定點(diǎn)突變所用引物Table 1 The primers of site-directed mutagenesis

圖1 PCR擴(kuò)增突變基因Fig.1 PCR amplification of the mutant gene

1.5 重組表達(dá)載體pET-28a-xynZF-2v1c構(gòu)建

用EcoRⅠ、HindⅢ限制性內(nèi)切酶雙酶切突變基因v1c和空質(zhì)粒pET-28a，反應(yīng)條件37℃、3h，酶切產(chǎn)物電泳，切膠回收。T4 DNA Ligase連接以上兩種雙酶切產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，涂布于含Kan抗性的LB固體培養(yǎng)基，構(gòu)建重組大腸桿菌BL21-pET-28a-xynZF-2v1c。篩選出陽性單克隆菌落，用于重組木聚糖基因的表達(dá)。

1.6 重組木聚糖酶基因xynZF-2和xynZF-2v1c的表達(dá)

將過夜培養(yǎng)的重組大腸桿菌BL21-pET-28axynZF-2v1c和 BL21-pET-28a-xynZF-2，以2%的接種量接種于含Kan的30 mL的LB培養(yǎng)基中，37℃，230 r/min培養(yǎng)至A600為0.6時(shí)，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，終濃度為2 mmol/L，37 ℃，230 r/min，誘導(dǎo)培養(yǎng) 2h，離心菌體，將沉淀菌體用10 mL檸檬酸-磷酸二氫鈉(pH 4.6)懸浮，并在冰水浴中超聲波破碎，10 000 r/min離心10 min，所得上清液即為粗酶液。

1.7 重組木聚糖酶XynZF-2和XynZF-2V1C的純化

采用鎳金屬螯合親和層析柱純化重組木聚糖酶，通過裝柱、平衡、上樣、洗滌等步驟，對(duì)含有His標(biāo)簽蛋白的原酶和突變酶進(jìn)行分離純化。收集洗脫的樣品液，即為重組原酶XynZF-2和突變酶XynZF-2V1C。采用5%濃縮膠和15%分離膠，對(duì)XynZF-2、XynZF-2V1C進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)，具體方法見參考文獻(xiàn)［9］。

1.8 重組木聚糖酶活性測(cè)定

采用DNS法測(cè)定木聚糖酶活性［11］。

酶活力單位(U)定義:將1 mL粗酶液溶于1.5 mL的0.5%樺木木聚糖中，40℃水浴反應(yīng)15 min，以每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量定義為1個(gè)單位。

1.9 重組木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)比較及分析

酶學(xué)性質(zhì)分析純化后的重組原酶和突變酶，測(cè)定最適溫度、熱穩(wěn)定性、最適pH以及pH穩(wěn)定性對(duì)木聚糖酶活性的影響［9］。Km及Vmax測(cè)定:以不同濃度的木聚糖為底物，分別在各自最適pH以及最適溫度下，測(cè)定重組原酶XynZF-2以及突變酶XynZF-2V1C酶活性。采用 Lineveaver-Burk法作圖，求出Km及Vmax。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組木聚糖酶同源序列比對(duì)分析及突變位點(diǎn)確定

利用Blast比對(duì)XynZF-2V1C的同源序列，發(fā)現(xiàn)來源于E.coli的11家族的木聚糖酶ENXYN11與XynZF-2V1C同源性較高(58.69%)，并以此為模板在SWISS-MODEL上對(duì) XynZF-2V1C同源建模(圖2)，并利用DNAMAN6.0以及DS ViewerPro6.0對(duì)氨基酸序列、木聚糖酶XynZF-2V1C結(jié)構(gòu)分析。同時(shí)，利用氨基酸結(jié)構(gòu)相似性，將第一個(gè)位點(diǎn)的纈氨酸突變?yōu)榘腚装彼?，纈氨酸半胱氨酸的側(cè)鏈末端分別為羥基和巰基，末端含有羥基的纈氨酸在水中不解離，而末端含有巰基的半胱氨酸的pKa為8.33，這使得水環(huán)境與XynZF-2V1C分子表面的相互作用降低，增加了N端與內(nèi)部結(jié)構(gòu)的相互作用［12］，使木聚糖酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性得到增強(qiáng)。以此為依據(jù)，利用大腸桿菌密碼子偏愛性設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增突變酶基因v1c。

圖2 XynZF-2V1C同源建模Fig.2 Homology modeling of XynZF-2V1C

2.2 重組表達(dá)載體構(gòu)建

利用DNAMAN6.0對(duì)突變基因v1c限制性酶切位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)突變基因v1c不含EcoRⅠ、HindⅢ酶切位點(diǎn)，對(duì)突變基因v1c引入EcoRⅠ、HindⅢ酶切位點(diǎn)，雙酶切，連接質(zhì)粒 pET-28a，構(gòu)建重組表達(dá)載體(圖3)。

圖3 重組表達(dá)載體pET-28a-xynZF-2v1c的構(gòu)建Fig.3 The construction of recombinant expression vector pET-28a-xynZF-2v1c

2.3 重組木聚糖酶在大腸桿菌中表達(dá)和純化

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21，構(gòu)建大腸桿菌工程菌。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，提取粗酶液，對(duì)含有His6標(biāo)簽的原酶和突變酶，采用鎳金屬螯合親和層析柱法得到純化的重組木聚糖酶，SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)純化的木聚糖酶XynZF-2和XynZF-2V1C，由圖4可見，原酶XynZF-2和突變酶XynZF-2V1C均在32 kDa處有明顯條帶，突變酶XynZF-2V1C與原酶XynZF-2相對(duì)分子質(zhì)量一致。

圖4 木聚糖酶XynZF-2、XynZF-2V1C的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of XynZF-2 and XynZF-2V1C

2.4 酶學(xué)性質(zhì)比較與分析

2.4.1 最適溫度及熱穩(wěn)定性比較分析

以DNS法測(cè)定原酶與突變酶最適溫度(圖5)，原酶XynZF-2最適溫度為40℃，而突變酶XynZF-2V1C最適溫度為50℃。相比原酶，突變酶最適溫度提高了10℃。兩種木聚糖酶熱穩(wěn)定性如圖6所示，原酶XynZF-2在45℃保溫20 min完全喪失活性，而突變酶XynZF-2V1C相對(duì)酶活性仍高達(dá)45%。且在45℃下的半衰期t45℃1/2，突變酶相對(duì)于原酶提高了10 min;在50℃保溫5 min，原酶相對(duì)酶活性降到了30%，而突變酶相對(duì)酶活性為60%左右，可見突變酶XynZF-2V1C相比原酶XynZF-2熱穩(wěn)定性明顯改善，表明木聚糖酶XynZF-2蛋白結(jié)構(gòu)中，氨基酸序列第1個(gè)位點(diǎn)引入半胱氨酸，改變了酶的構(gòu)象，增強(qiáng)了N端與內(nèi)部結(jié)構(gòu)的相互作用，突變酶對(duì)溫度的敏感性減弱，熱穩(wěn)定性明顯改善。

圖5 溫度對(duì)木聚糖酶活性的影響Fig.5 Effect of temperature on xylanase activity

圖6 木聚糖酶熱穩(wěn)定性比較Fig.6 Comparison of the thermostability of xylanase

2.4.2 pH對(duì)酶活性的影響

對(duì)XynZF-2和XynZF-2V1C酸堿性分析發(fā)現(xiàn)，2種酶最適 pH均為5.0，沒有發(fā)生變化(圖7)。且XynZF-2和XynZF-2V1C均在pH 5.0～9.0較為穩(wěn)定，相對(duì)酶活性均在50%以上(圖8)?？梢娭亟M酶XynZF-2第1個(gè)位點(diǎn)氨基酸由纈氨酸突變?yōu)榘腚装彼峄緦?duì)該酶的酸堿性沒有影響。

圖7 pH對(duì)木聚糖酶活性的影響Fig.7 Effect of pH on the xylanase activity

圖8 木聚糖酶pH的穩(wěn)定性比較Fig.8 Comparison of the pH stability of xylanase

2.4.3 酶動(dòng)力學(xué)分析

以1～10 mg/mL樺木木聚糖為底物，測(cè)定XynZF-2和 XynZF-2V1C酶活性，采用 Lineveaver-Burk法作，計(jì)算出XynZF-2和XynZF-2V1C的Km分別9.96和12.4 mg/mL，Vmax分別為 74.63和90.91 U/mg。由此可見，突變酶與原酶相比，Km變小，這使得突變酶XynZF-2V1C與底物的親和力變小，而Vmax變大，有可能使得突變酶XynZF-2V1C的酶活性得到提高。

3 討論

隨著木聚糖酶工業(yè)應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)展，對(duì)于木聚糖酶特性的改善引起了人們的廣泛關(guān)注，尤其是對(duì)木聚糖酶熱穩(wěn)定性的提高，逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)［13］。隨著生物技術(shù)以及生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，對(duì)木聚糖酶結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)不斷深入，在木聚糖酶結(jié)構(gòu)內(nèi)發(fā)現(xiàn)催化結(jié)構(gòu)域、底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及熱穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域等［14］。很多研究者通過各種生物技術(shù)手段對(duì)木聚糖酶熱穩(wěn)定性進(jìn)行改造，如 Rutchadaporn等［15］用 Arg替代來源于A.niger BCC14405的木聚糖酶的Ser/Thr平面的一些Ser和Thr，熱穩(wěn)定性提高了將近20倍左右。

研究表明，N端氨基酸的改變對(duì)木聚糖酶的熱穩(wěn)定性有一定的影響［16］。本研究通過對(duì)XynZF-2蛋白結(jié)構(gòu)分析比較以及氨基酸特性研究，將第1個(gè)位點(diǎn)的纈氨酸突變?yōu)榘腚装彼幔@使突變酶XynZF-2V1C相比原酶XynZF-2，最適溫度提高了10℃;45℃下的半衰期t1/245℃，突變酶相對(duì)于原酶提高了10 min左右，熱穩(wěn)定性大大提高。通過單一氨基酸位點(diǎn)的突變而使木聚糖酶XynZF-2V1C熱穩(wěn)定性大大提高，為木聚糖酶XynZF-2V1C后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

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