鯖魚(yú)加工廢棄物分段發(fā)酵過(guò)程中生化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化

劉書(shū)來(lái)，柯玉原，周緒霞，丁玉庭

(浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，浙江杭州，310014)

近年來(lái)隨著我國(guó)海底層經(jīng)濟(jì)魚(yú)類資源的衰退，使鯖魚(yú)等中上層魚(yú)類資源越顯豐富，其年產(chǎn)量維持在40多萬(wàn)t，從而成為我國(guó)東海區(qū)海洋漁業(yè)中具有重要地位的魚(yú)獲物之一。鯖魚(yú)可被加工成魚(yú)脯、魚(yú)糜、魚(yú)罐頭等產(chǎn)品，但是生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生40% ～60%的加工廢棄物［1］。目前對(duì)魚(yú)類加工廢棄物的利用方式有很多，比如:將魚(yú)皮處理成皮革［2］;將魚(yú)鱗做成天然吸附劑;分離酶、明膠和具有抗微生物和抗腫瘤能力的蛋白質(zhì)［3］;通過(guò)生物煉制方法生產(chǎn)生物燃料以及其他各種大容量化工原料及產(chǎn)品［4］;在魚(yú)廢棄物中添加植物乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵［5］或添加其他乳酸菌生產(chǎn)動(dòng)物飼料產(chǎn)品［6-7］;也有研究者在回收的魚(yú)廢物中接種乳酸菌和酵母混合物，測(cè)試乳酸菌和酵母菌在魚(yú)廢棄物中的活性，并獲得互補(bǔ)的成分形成了均衡的食物配給動(dòng)物食用［8］。

因植物乳桿菌是厭氧細(xì)菌(兼性好氧)，活菌數(shù)比較高，能大量產(chǎn)酸，能有效控制發(fā)酵液的pH環(huán)境抑制腐敗性微生物和堿性物質(zhì)的產(chǎn)生。產(chǎn)朊假絲酵母是高蛋白源，其可優(yōu)化廢棄物的蛋白組成，并已用于生產(chǎn)幾種工業(yè)產(chǎn)品［9］。本試驗(yàn)先在鯖魚(yú)廢棄物中添加葡萄糖、植物乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵，降低發(fā)酵環(huán)境的pH，到一定程度后再添加產(chǎn)朊假絲酵母，并考察短時(shí)連續(xù)分段發(fā)酵過(guò)程中鯖魚(yú)加工廢棄物的生化指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化。

1 材料與方法

1.1 原料與菌種

1.1.1 原料

原料為鯖魚(yú)罐頭產(chǎn)品加工后的廢棄物，由臺(tái)州興旺水產(chǎn)有限公司提供。

1.1.2 菌種

產(chǎn)朊假絲酵母Y150(Candida utilis)和植物乳桿菌B758(Lactobbacillus phan)，上海市工業(yè)微生物研究所菌種保藏中心提供。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

NaOH、HClO4、HCl、甲醛、山梨酸、Na2SO3、CuSO4·5H2O、NaKC4H4O6·4H2O、H3BO3、C2HO2Cl3等均為分析純。

1.2.2 主要儀器

PHS-3C型數(shù)顯酸度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;AR2130電子精密天平，華東醫(yī)藥有限公司;HR2860型打漿機(jī)，上海飛利浦有限公司;K9840型自動(dòng)凱氏定氮儀，海能儀器;UV-7504型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，上海欣茂儀器有限公司;LRH-250F型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;TCL-16M型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;SKY-111B型低溫恒溫振蕩搖床，上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 發(fā)酵劑制備

將植物乳桿菌接入 MRS肉湯培養(yǎng)基中，于30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，然后離心(8 000r/min，10 min)后，用0.85% 生理鹽水沖洗并調(diào)整至植物乳桿菌濃度約為12 g/L。

將產(chǎn)朊假絲酵母接入WORT肉湯培養(yǎng)基中，于30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，然后離心(5 000 r/min，10 min)后，用0.85%生理鹽水沖洗并調(diào)整至產(chǎn)朊假絲酵母濃度約為19 g/L。

1.4 發(fā)酵過(guò)程

將鯖魚(yú)加工廢棄物切碎，采用打漿機(jī)打碎后剁碎成魚(yú)糜狀，稱量60 g于250 mL三角瓶中，添加20 mL水，巴氏殺菌(75℃，20 min)，并添加已單獨(dú)滅菌的0.2 g/mL葡萄糖溶液7.2 mL，作為發(fā)酵培養(yǎng)基。

采用分段發(fā)酵方式，先在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種5%(v/w)植物乳桿菌于30℃下厭氧發(fā)酵6 h，再接種5%(v/w)產(chǎn)朊假絲酵母并分別在25、30、35℃下好氧發(fā)酵42 h。

1.5 分析方法

1.5.1 微生物平板計(jì)數(shù)

參考GB 4789.2-2010無(wú)菌操作方式。植物乳桿菌采用MRS瓊脂培養(yǎng)基，并加入2 g/L山梨酸以抑制產(chǎn)朊假絲酵母生長(zhǎng)，在37℃培養(yǎng)(72±3)h后計(jì)數(shù);產(chǎn)朊假絲酵母采用麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基，在28℃下培養(yǎng)(72±3)h后計(jì)數(shù)。

1.5.2 pH值測(cè)定

參照GB/T 5009.45-2003。

1.5.3 總酸、氨基態(tài)氮含量測(cè)定

總酸參照GB/T 12456-2008測(cè)定，氨基態(tài)氮含量測(cè)定是在測(cè)定總酸后的樣品中加入10 mL 36%～38%的甲醛溶液，用0.05 mol/L NaOH滴定至pH 9.2。

1.5.4 水溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定［10］

采用雙縮脲法，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.529 4x+0.007 6，R2=0.999 2。

1.5.5 揮發(fā)性鹽基氮含量測(cè)定

參照SC/T 3032—2007。

1.5.6 非蛋白氮含量測(cè)定［11］

本試驗(yàn)稱取樣品約5.000 g于錐形瓶中，加入50 mL蒸餾水靜置30 min，然后加入10 mL 10% 三氯乙酸溶液靜置30 min，濾紙過(guò)濾，殘?jiān)萌纫宜崛芤簺_洗2次，凱氏定氮儀定氮。

1.5.7 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21和Excel 2007軟件，數(shù)據(jù)均以平均值±SD表示，采用最小顯著差異法(LSD)進(jìn)行差異顯著性分析，顯著性水平設(shè)置為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物變化

表1為鯖魚(yú)加工廢棄物發(fā)酵過(guò)程中植物乳桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母的生物量隨發(fā)酵時(shí)間的變化情況。厭氧發(fā)酵階段中植物乳桿菌在厭氧和葡萄糖存在的條件下快速生長(zhǎng)繁殖，由初始7.83 lg(CFU/g)快速上升至8.61 lg(CFU/g)。6 h后開(kāi)始進(jìn)入好氧發(fā)酵階段，在25、30和35℃下，因植物乳桿菌是兼性厭氧菌，仍能繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)分別達(dá)到8.98、9.11、8.77 lg(CFU/g);產(chǎn)朊假絲酵母在 25 和30℃下，快速生長(zhǎng)繁殖，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)分別達(dá)到6.52、6.64 lg(CFU/g)，但在35℃，產(chǎn)朊假絲酵母生物量在6～30 h之間上升，30～48 h之間下降，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)為5.3 lg(CFU/g)。30 h后產(chǎn)朊假絲酵母生物量顯著小于其他兩個(gè)溫度下的產(chǎn)朊假絲酵母生物量(P＜0.05)。主要原因是35℃過(guò)高，不利于產(chǎn)朊假絲酵母生長(zhǎng)繁殖。從發(fā)酵結(jié)果可以看出，本試驗(yàn)中3個(gè)發(fā)酵溫度對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)繁殖影響差異不大，而25和30℃下，產(chǎn)朊假絲酵母生物量有所增加，提高了發(fā)酵基質(zhì)中單細(xì)胞蛋白含量。另外，植物乳桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母可以共同生長(zhǎng)是因?yàn)槿樗峋c酵母菌之間存在代謝產(chǎn)物互補(bǔ)機(jī)制［12］，酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中為乳酸菌提供了許多營(yíng)養(yǎng)因子例如氨基酸、維生素和丙酮酸鹽等其他物質(zhì)［13］，而乳酸菌的代謝產(chǎn)物又為酵母菌提供了能量來(lái)源［14］。

表1 分段發(fā)酵過(guò)程中植物乳桿菌及產(chǎn)朊假絲酵母的生物量變化Tabel 1 Biomass changes of L.phan and C.utilis in segmented fermentation process

2.2 pH和總酸的變化

圖1為鯖魚(yú)加工廢棄物發(fā)酵過(guò)程中pH和總酸含量的變化。第1發(fā)酵階段中pH快速下降，從初始6.48降至5.46。第2發(fā)酵階段中pH在6～12 h繼續(xù)下降至4.80左右，而12～48 h，pH變化趨于平緩，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)略有上升。pH的變化趨勢(shì)與Hernan等［6］在魚(yú)廢棄物中添加植物乳桿菌制備魚(yú)青貯飼料的結(jié)果一致。pH快速下降可能是由于植物乳桿菌在厭氧發(fā)酵條件下急速生長(zhǎng)和繁殖產(chǎn)生大量有機(jī)酸引起的。而pH在發(fā)酵后期趨于平緩且略有上升，一方面可能與產(chǎn)朊假絲酵母生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中利用了植物乳桿菌產(chǎn)生的乳酸有關(guān)［15］;另一方面可能是發(fā)酵液的酸性環(huán)境使蛋白質(zhì)發(fā)生降解，產(chǎn)生一些堿性含氮物質(zhì)，或者是原料中的腐敗菌生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生胺類物質(zhì)，中和酸性物質(zhì)所致［16］。25、30和35℃三個(gè)發(fā)酵溫度之間的pH相差不大，總酸含量也無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，總酸含量變化趨勢(shì)與pH呈負(fù)相關(guān)。

圖1 分段發(fā)酵過(guò)程中pH和總酸含量的變化Fig.1 Changes of pH and total acid in segmented fermentation process

2.3 水溶性蛋白質(zhì)含量變化

圖2為鯖魚(yú)加工廢棄物發(fā)酵過(guò)程中水溶性蛋白含量的變化情況。第1發(fā)酵階段中水溶性蛋白質(zhì)含量在0～6 h略有上升。第2發(fā)酵階段中水溶性蛋白質(zhì)含量在25、30和35℃三個(gè)不同溫度條件下均逐漸下降，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)分別為0.74、0.98和0.63 g/100 g。一方面可能是較低的pH發(fā)酵環(huán)境改變了鯖魚(yú)廢棄物蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)引起的［17］;另一方面可能是菌種本身產(chǎn)生的蛋白酶使蛋白質(zhì)降解［16］引起的。由圖2可知，35℃下水溶性蛋白質(zhì)含量下降速率比25和30℃下水溶性蛋白質(zhì)含量下降速率快，但是35℃下產(chǎn)朊假絲酵母菌生物量低于其他兩組，可推測(cè)植物乳桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母產(chǎn)的蛋白酶不是影響水溶性蛋白質(zhì)含量下降的主要原因，而35℃下的pH低于其他兩組，可推測(cè)酸性環(huán)境是水溶性蛋白質(zhì)降解的主要原因。

圖2 分段發(fā)酵過(guò)程中水溶性蛋白質(zhì)含量的變化Fig.2 Changes of water-soluble protein in segmented fermentation process

2.4 氨基態(tài)氮含量變化

氨基態(tài)氮是指以氨基酸形式存在的氮元素的含量。由圖3可知，第1發(fā)酵階段中，氨基態(tài)氮含量在0～6 h逐漸上升，從初始0.28 g/100 g上升至0.30 g/100 g。第2發(fā)酵階段中氨基態(tài)氮含量在25、30和35℃三個(gè)不同溫度條件下均逐漸上升，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)分別為0.31、0.43和0.36 g/100 g。氨基態(tài)氮含量變化與水溶性蛋白含量變化總體呈負(fù)相關(guān)，也是由于蛋白質(zhì)降解形成氨基酸引起的。雖然在6～48 h，30℃下氨基態(tài)氮含量較高，但是25、30和35℃三個(gè)發(fā)酵溫度下的氨基態(tài)氮含量均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

圖3 分段發(fā)酵過(guò)程中氨基態(tài)氮含量的變化Fig.3 Changes of amino nitrogen in segmented fermentation process

2.5 揮發(fā)性鹽基氮含量變化

揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)是用于評(píng)價(jià)揮發(fā)性胺類物質(zhì)形成的重要指標(biāo)，并可表征發(fā)酵過(guò)程中腐敗微生物及其代謝形成腐敗性物質(zhì)的變化規(guī)律。由圖4可知，第1發(fā)酵階段中，TVB-N含量在0～6 h略有下降，從初始62.26 mg/100 g下降至60.99 mg/100 g。第2發(fā)酵階段中TVB-N含量在25、30和35℃下均先快速下降，接著趨于平緩，最后逐漸上升，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)分別為48.59、53.97和55.69 mg/100 g。并且25℃下TVB-N含量顯著低于30和35℃下TVB-N含量 (P ＜0.05)。Hu Yongjin等［18］認(rèn)為，TVB-N 含量下降是因?yàn)槿樗峋a(chǎn)生的乳酸和抗菌素中和了TVB-N引起的。而M.H.EI Jalil等認(rèn)為，TVB-N含量高低與蛋白質(zhì)降解有關(guān)［19］，TVB-N含量在發(fā)酵后期逐漸上升可能是由于腐敗微生物與酶使含氮化合物如蛋白質(zhì)、肽、氨基酸等發(fā)生脫氨基或者分解反應(yīng)，并使之轉(zhuǎn)化為氨基酸和揮發(fā)性氮［20］。

圖4 分段發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性鹽基氮含量的變化Fig.4 Changes of total volatile base nitrogen in segmented fermentation process

2.6 非蛋白氮含量變化

非蛋白氮(NPN)在飼料加工領(lǐng)域是飼料中蛋白質(zhì)以外的含氮化合物的總稱，包括游離氨基酸、蛋白質(zhì)降解的含氮化合物、氨以及銨鹽等簡(jiǎn)單含氮化合物。由圖5可知，第1發(fā)酵階段中，NPN含量在0～6 h逐漸上升，從8.8 mg/g上升至9.06 mg/g。第2發(fā)酵階段中，NPN含量在25、30和35℃三個(gè)不同溫度下均逐漸上升，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)分別為11.15、11.36和11.90 mg/g。NPN含量的變化趨勢(shì)與AHammoumi等［5］在魚(yú)廢棄物中添加植物乳桿菌后用于飼養(yǎng)肉仔雞的研究中的變化趨勢(shì)一致。NPN的變化趨勢(shì)可能是一些微生物或內(nèi)源性酶將蛋白氮轉(zhuǎn)化成NPN引起的［5］;也可能是較低的pH值使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，促進(jìn)NPN含量增加［21］。雖然35℃下NPN含量最高，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)達(dá)到11.90 mg/g，但是25、30和35℃三個(gè)不同發(fā)酵溫度對(duì)非蛋白氮含量影響差異不大。

圖5 分段發(fā)酵過(guò)程中非蛋白氮含量的變化Fig.5 Changes of non-protein nitrogen in segmented fermentation process

3 結(jié)論

本研究以鯖魚(yú)加工廢棄物為發(fā)酵原料，以植物乳桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母為發(fā)酵劑，探索提高鯖魚(yú)加工廢棄物高值化利用的途徑。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，水溶性蛋白質(zhì)含量降低，非蛋白氮含量上升，氨基態(tài)氮含量由初始0.28 g/100 g分別提高至0.31、0.43和0.36 g/100 g，表明發(fā)酵劑一定程度上利用鯖魚(yú)加工廢棄物中蛋白質(zhì)，提高了發(fā)酵基質(zhì)中的多肽和氨基酸含量;pH變化與TVB-N變化呈正相關(guān)，TVB-N含量從初始62.26 mg/100 g分別降低至48.59、53.97和55.69 mg/100 g，表明添加植物乳桿菌能夠充分抑制腐敗微生物生長(zhǎng)繁殖，保證發(fā)酵環(huán)境的安全性，同時(shí)為產(chǎn)朊假絲酵母生長(zhǎng)繁殖提供有利條件;溫度變化對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)繁殖影響不大，其生物量均有所提高，從初始7.83 lg(CFU/g)分別上升至8.98、9.11 和8.77 lg(CFU/g);產(chǎn)朊假絲酵母生物量從初始5.62 lg(CFU/g)分別上升至6.52、6.64 lg(CFU/g)和下降至5.30 lg(CFU/g)，表明25和30℃下利于產(chǎn)朊假絲酵母生長(zhǎng)繁殖，發(fā)酵基質(zhì)中單細(xì)胞蛋白含量會(huì)增加，這也提高了鯖魚(yú)加工廢棄物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而35℃下不利于產(chǎn)朊假絲酵母的生長(zhǎng)繁殖。

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