丙酮酸差量法測(cè)定大蒜中大蒜辣素含量方法的建立*

朱君芳，許建，高杰

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院，新疆烏魯木齊830052)

大蒜(Allium sativum L.)是百合科(Liliaceae)蔥屬(Allium)草本植物，是一種蔥蒜類蔬菜，以鱗莖、嫩葉和花莖為食用器官，是一種重要的調(diào)味蔬菜［1］。原產(chǎn)于歐洲南部、西亞和中亞，西漢時(shí)期傳入我國(guó)［2］。目前大蒜在我國(guó)已廣泛栽培，主要產(chǎn)地有河南、山東、河北、甘肅、江蘇及新疆等地［3-4］。

大蒜有消炎、殺菌、降低膽固醇、抗癌、以及增強(qiáng)免疫力等多種功效。大蒜的藥用價(jià)值主要來(lái)源于大蒜辣素(allicin)。大蒜辣素極易揮發(fā)，是一種具有特殊氣味的無(wú)色油狀物質(zhì)［5-9］。大蒜辣素以前體物質(zhì)蒜氨酸存在于大蒜中，在完整的細(xì)胞中，蒜氨酸存在于細(xì)胞質(zhì)中，而蒜氨酸酶存在于液泡中，細(xì)胞破碎后二者接觸，繼而蒜氨酸發(fā)生轉(zhuǎn)化，生成大蒜辣素［10-11］。大蒜辣素藥用價(jià)值大，可加工為保健品和藥品等，應(yīng)用前景較廣闊。

目前，大蒜辣素含量的測(cè)定方法主要有氣相色譜(GC)、氣相色譜-質(zhì)譜連用(GC-MS)、液相色譜(LC)、高效液相色譜(HPLC)、硝酸汞滴定法、定硫法和分光光度計(jì)法等。其中分光光度計(jì)法不需大蒜辣素標(biāo)準(zhǔn)樣品，操作簡(jiǎn)單、快速、成本低，較為實(shí)用，因此該方法的應(yīng)用最為廣泛［12-16］。目前，雖然關(guān)于分光光度計(jì)法測(cè)定大蒜辣素的研究很多，但相關(guān)報(bào)道卻不一致，如待測(cè)指標(biāo)、藥品試劑、提取方法和提取條件等有所不同。由于大蒜辣素穩(wěn)定性差，因此測(cè)定較為困難［14-15］。本文采用丙酮酸差量法測(cè)定大蒜鱗莖中的大蒜辣素，不需大蒜辣素標(biāo)準(zhǔn)樣品，操作簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確性高，較為實(shí)用。

1 試驗(yàn)原理及材料方法

1.1 試驗(yàn)原理

應(yīng)用曹建康［17］等測(cè)定果蔬組織中丙酮酸含量的方法，大蒜鱗莖組織提取液中所含的丙酮酸與2，4-二硝基苯肼發(fā)生反應(yīng)，生成丙酮酸-2，4-二硝基苯腙，此產(chǎn)物在堿性環(huán)境中呈櫻桃紅色，并且在520 nm處有顯著光吸收。該反應(yīng)所呈現(xiàn)的顏色深淺程度與溶液中的丙酮酸含量呈正相關(guān)。

本試驗(yàn)中，2分子蒜氨酸在蒜氨酸酶的作用下，分解產(chǎn)生1分子大蒜辣素，同時(shí)產(chǎn)生2分子丙酮酸，反應(yīng)式如下:

由于未經(jīng)受損的大蒜鱗莖組織中含有丙酮酸，故應(yīng)將大蒜鱗莖經(jīng)滅酶處理，去除本底的影響，再計(jì)算得出鱗莖組織中的大蒜辣素含量。計(jì)算方法如下:

經(jīng)滅酶后測(cè)得滅酶組的吸光度值分別為A1、A2、A3，測(cè)定組的吸光度值分別為A1'、A2'、A3'。可由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得丙酮酸的質(zhì)量，從而計(jì)算出丙酮酸的含量。滅酶組丙酮酸含量(即本底)為m1、m2、m3，測(cè)定組丙酮酸含量為 m1'、m2'、m3'。計(jì)算大蒜辣素生成過(guò)程中產(chǎn)生丙酮酸的量為M=(m1'+m2'+m3')/3-(m1+m2+m3)/3;由此得:

1.2 試驗(yàn)材料與試劑

市購(gòu)新疆吉木薩爾縣的白皮大蒜，置于(0±1)℃冷庫(kù)中保存。

三氯乙酸、2，4-二硝基苯肼、氫氧化鈉、丙酮酸、濃鹽酸:分析純，天津盛奧化學(xué)試劑有限公司。

1.3 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

電子天平，AR2130/C 型，Pine Brook，NJ，USA;打漿機(jī)，飛利浦HR2860/60/A型，珠海飛利浦家庭電器有限公司;電熱恒溫水箱，-600型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;離心機(jī)，XYJ80-2型，江蘇姜堰市醫(yī)療器械有限公司;可見(jiàn)光分光光度計(jì)，721型，上海菁華科技儀器有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取6支試管，分別編號(hào)，按表1加入各種試劑。

表1 繪制丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)各試劑加入量Table 1 The amount of each reagent drawing pyruvic acid standard curve

在上述各試管中分別加入1.0 mL 1g/L的2，4-二硝基苯肼溶液，搖勻，再加入5.0 mL 1.5 mol/L的NaOH溶液，搖勻，進(jìn)行顯色反應(yīng)10 min。然后以0號(hào)試管為空白參比，在波長(zhǎng)520 nm處進(jìn)行比色測(cè)定，并以吸光度值為縱坐標(biāo)，丙酮酸的質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線性回歸方程。

1.4.2 丙酮酸差量法測(cè)定大蒜辣素條件的優(yōu)化

1.4.2.1 大蒜本底中丙酮酸含量的測(cè)定及滅酶時(shí)間的優(yōu)化

取完整無(wú)損傷的大蒜鱗莖鮮樣約20 g，去皮，在100 ℃水浴條件下分別加熱0、10、20、30、40 min 進(jìn)行滅酶。然后打漿，分別取樣3份，各2 g，并用80 g/L的三氯乙酸溶液定容至25 mL，搖勻。4 000×g離心10 min后可收集上清液，即為提取液。

取0.5 mL提取液于試管中，加入80 g/L的三氯乙酸溶液2.5 mL、1 g/L的2，4-二硝基苯肼溶液1.0 mL，搖勻。再加入1.5 mol/L的NaOH溶液5.0 mL，搖勻，進(jìn)行顯色反應(yīng)10 min后，按照與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法，以0號(hào)試管為空白參比，在波長(zhǎng)520 nm處進(jìn)行比色測(cè)定，并記錄吸光度值。

1.4.2.2 大蒜辣素最佳酶促反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

取鮮樣約40 g，打漿，將樣品置于30℃水浴鍋內(nèi)水浴加熱，進(jìn)行酶促反應(yīng)。分別在反應(yīng)0、10、20、30、40、50、60 min時(shí)各取樣 3 份，每份2 g，用80 g/L 的三氯乙酸溶液定容至25 mL，搖勻。4 000×g離心10 min后，收集上清液即為提取液。

取0.1 mL提取液于試管中，分別加入80 g/L的三氯乙酸溶液2.9 mL、1 g/L的2，4-二硝基苯肼溶液1.0 mL，搖勻。再加入1.5 mol/L的NaOH溶液5.0 mL，搖勻，進(jìn)行顯色反應(yīng)10 min，然后在波長(zhǎng)520 nm處進(jìn)行比色測(cè)定，并記錄吸光度值。

1.4.2.3 大蒜辣素最佳酶促反應(yīng)溫度的優(yōu)化

取鮮樣約20 g，重復(fù)6次，打漿均勻后分別置于20、25、30、35、40、45 ℃ 水浴鍋內(nèi)進(jìn)行酶促反應(yīng) 10 min，各取樣3份，每份2 g，用80 g/L的三氯乙酸溶液定容至25 mL，搖勻。4 000×g離心10 min后，收集上清液即為提取液。

取0.1 mL提取液于試管中，加入80 g/L的三氯乙酸溶液2.9 mL、1 g/L的2，4-二硝基苯肼溶液1.0 mL，搖勻。再加入1.5 mol/L的NaOH溶液5.0 mL，搖勻，進(jìn)行顯色反應(yīng)10 min，在波長(zhǎng)520 nm處進(jìn)行比色測(cè)定，并記錄其吸光度值。

1.4.3 丙酮酸差量法測(cè)定大蒜辣素方法的評(píng)價(jià)

1.4.3.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱取無(wú)損傷的大蒜鱗莖20 g并打漿，按照試驗(yàn)所確定的最佳反應(yīng)條件制備樣品提取液。取樣品提取液，按照測(cè)定條件反應(yīng)完全后，分別靜置0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h后測(cè)定并記錄吸光度值，分析吸光度值的變化情況，以評(píng)價(jià)該測(cè)定方法在一定時(shí)間段內(nèi)的穩(wěn)定性。

1.4.3.2 精密度試驗(yàn)

應(yīng)用本試驗(yàn)所確定的最佳酶促反應(yīng)條件制備樣品提取液，并重復(fù)10次取該提取液，按照測(cè)定條件反應(yīng)完全后，進(jìn)行吸光度測(cè)定，計(jì)算出各自大蒜辣素的含量，然后計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，以評(píng)價(jià)該測(cè)定方法的精密度。

1.4.3.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

按照最佳酶促反應(yīng)條件制備大蒜鱗莖組織樣品，取5份該樣品，每份2 g，并制備樣品提取液，分別取樣品提取液并按照測(cè)定條件反應(yīng)完全，然后測(cè)定吸光度，計(jì)算它們的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，以評(píng)價(jià)該測(cè)定方法的重現(xiàn)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按照1.4.1的方法，以丙酮酸的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，建立丙酮酸測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。丙酮酸濃度在10～50 μg/mL內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，y=0.013 5x-0.000 4(R2=0.999 9)

2.2 丙酮酸差量法最佳測(cè)定條件的確定

2.2.1 最佳滅酶時(shí)間的確定

分別對(duì)滅酶 0，10，20，30，40 min 后的提取液進(jìn)行吸光度測(cè)定，計(jì)算得出丙酮酸含量依次為354.25、72.14、68.42、69.51、69.38 mg/100g(圖 1)。滅酶0 min時(shí)丙酮酸含量最高，滅酶10 min后丙酮酸含量逐漸降低，滅酶時(shí)間為20，30，40 min時(shí)丙酮酸含量趨于穩(wěn)定，因此，水浴加熱30 min可徹底滅酶，故本試驗(yàn)滅酶時(shí)間選擇30 min。

圖1 丙酮酸含量隨滅酶時(shí)間的變化Fig.1The effect of enzyme inactivation time on content of pyruvic acid

2.2.2 最佳酶促反應(yīng)時(shí)間的確定

分別在 0，10，20，30，40，50，60 min 后取樣并測(cè)定吸光度值，計(jì)算可得大蒜辣素含量分別為355.56，378.11，348.98，301.00，268.14，233.82，181.01 mg/100g(圖2)。大蒜鱗莖打漿10 min內(nèi)，大蒜辣素含量逐漸增大，10～60 min內(nèi)，大蒜辣素含量逐漸下降，由此可知，丙酮酸差量法測(cè)定大蒜辣素含量的最佳酶促反應(yīng)時(shí)間為10 min。

2.2.3 最佳酶促反應(yīng)溫度的確定

將樣品分別置于20，25，30，35，40，45 ℃水浴鍋內(nèi)進(jìn)行酶促反應(yīng)，10 min后取樣，經(jīng)測(cè)定、計(jì)算可得大蒜辣素含量分別為322.43，324.43，354.92，322.95，271.62，204.81 mg/100g(圖3)。溫度在20～30℃內(nèi)，大蒜辣素含量隨溫度的升高而增大，30～45℃內(nèi)，大蒜辣素含量隨溫度的升高而減小，30℃時(shí)進(jìn)行酶促反應(yīng)使得大蒜辣素含量最高，由此可知，丙酮酸差量法測(cè)定大蒜辣素含量的最佳酶促反應(yīng)溫度為30℃。該方法與朱平華［18］等在正交試驗(yàn)優(yōu)化大蒜素的提取試驗(yàn)中的研究結(jié)果一致。

圖2 大蒜辣素含量隨酶促反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.2 Effect of enzymatic reaction time on content of allicin

圖3 大蒜辣素含量隨酶促反應(yīng)溫度對(duì)的變化Fig.3 Effect of enzymatic reaction temperature on content of allicin

2.3 丙酮酸差量法測(cè)定大蒜辣素方法的評(píng)價(jià)

2.3.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

同一樣品的提取液經(jīng)顯色反應(yīng)后在不同時(shí)間段測(cè)定其吸光度，如表2所示，計(jì)算得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.409%。吸光度值減少量約0.01/0.5 h，故樣品反應(yīng)液的吸光度需在0.5 h內(nèi)測(cè)定，即可將誤差控制在0.01內(nèi)，3 h后吸光度值減少0.05。因此，該試驗(yàn)的樣品提取液經(jīng)顯色反應(yīng)后需盡快測(cè)定吸光度值，以減少誤差。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 2 Results of stability experiment

2.3.2 精密度試驗(yàn)

對(duì)同一大蒜鱗莖組織的提取液測(cè)定10次吸光度，計(jì)算得大蒜辣素含量分別為380.17，385.47，392.74，387.25，385.61，383.22，386.79，383.69，389.09，385.74 mg/100g，計(jì)算得出平均大蒜辣素含量為385.98 mg/100g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.88%，由此可知，該測(cè)定方法的精密度較好。

2.3.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

測(cè)定5份經(jīng)同樣處理的樣品提取液的吸光度值，分別為 0.457、0.446、0.458、0.452、0.453，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.05%，由此可知此方法具有較好的重現(xiàn)性。

3 結(jié)論

該方法借鑒2，4-二硝基苯肼法測(cè)定丙酮酸含量的方法，通過(guò)測(cè)定滅酶后和經(jīng)酶促反應(yīng)后大蒜鱗莖中丙酮酸的含量，由丙酮酸的差量計(jì)算出大蒜鱗莖中大蒜辣素的含量。

試驗(yàn)優(yōu)化測(cè)定條件為，100℃水浴加熱滅酶30 min，酶促反應(yīng)溫度為30℃，酶促反應(yīng)時(shí)間為10 min，在520 nm處測(cè)定吸光度值，丙酮酸含量濃度在10～50 μg/mL內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系(R2=0.999 9)，精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.88%，重現(xiàn)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.05%。由此可見(jiàn)，此方法耗材少，操作簡(jiǎn)單，精密度較高，重現(xiàn)性好，適宜測(cè)定大蒜鱗莖中大蒜辣素含量。

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