左旋精氨酸對(duì)肺高壓大鼠體內(nèi)循環(huán)微粒的影響

王旭蘭，王群讓，康 平，宋寶國，常鳳軍(咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院護(hù)理部，咸陽 7000;陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科;延安大學(xué)附屬醫(yī)院東關(guān)醫(yī)院心腦血管外科;陜西省人民醫(yī)院心臟外科;通訊作者，E-mail:changfengjun00@6．com)

肺高壓(pulmonary hypertension，PH)的病理機(jī)制復(fù)雜、病情進(jìn)行性加重，而且預(yù)后差。PH的病理特征包括:肺血管阻力持續(xù)性增加、肺血管增殖及重塑、肺血管血栓形成及肺血管進(jìn)行性閉塞［1］。但是目前PH的治療藥物針對(duì)性差，找到治療PH的特異性藥物是目前的當(dāng)務(wù)之急。

我們前期的研究［2］及其他學(xué)者［3］的研究發(fā)現(xiàn)左旋精氨酸(L-arginine，L-Arg)可通過改善內(nèi)皮功能緩解PH。最近的研究［4］還發(fā)現(xiàn)循環(huán)微粒(circulating microparticles，MPs)可以損害包括肺動(dòng)脈在內(nèi)的血管內(nèi)皮功能。那么L-Arg改善PH是否直接通過影響MPs來實(shí)現(xiàn)，目前尚無報(bào)道，本研究將探討L-Arg對(duì)PH大鼠體內(nèi)MPs含量及質(zhì)量的影響，以進(jìn)一步了解L-Arg防治PH的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要儀器和試劑

SPF級(jí)雄性Sprague Dawley(SD)大鼠18只，體重(200±10)g，購自陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀為美國BIO-RAD產(chǎn)品，BI-420E+生物機(jī)能試驗(yàn)系統(tǒng)購自成都泰盟科技有限公司，PVDF膜購自瑞士羅氏公司、X射線攝影暗匣及中速感感光屏(AX－Ⅱ型)購自廣東粵華公司，超聲破碎儀購自美國Cole-Parmer。TEMED購自美國Sigma-Aldrich。野百合堿(monocrotaline，MCT)、左旋精氨酸(L-arginine，L-Arg)、戊巴比妥鈉和RIPA裂解液為美國Sigma-Aldrich產(chǎn)品，RPMI1640、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)購自美國Gibico公司，eNOS購自Santa Cruz公司，BCA試劑盒為美國Thermo Scientific產(chǎn)品。

1．2 肺高壓模型建立及分組

按文獻(xiàn)［5］的方法制備PH模型:用乙醇和生理鹽水(2∶8)混合液將野百合堿配成20 g/L的溶液，用生理鹽水將L-Arg配成150 g/L的溶液。18只雄性SD大鼠隨機(jī)分為三組(n=6):對(duì)照組、MCT組、L-Arg組。除對(duì)照組外，MCT組和L-Arg組大鼠腹腔注射MCT 50 mg/kg誘導(dǎo)PH并飼養(yǎng)3周。期間L-Arg組每日腹腔注射L-Arg(500 mg/kg)，對(duì)照組和MCT組每日腹腔注射等量的生理鹽水。

1．3 大鼠肺動(dòng)脈壓力的測定

飼養(yǎng)滿3周時(shí)，戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉大鼠后，通過BL-420E生物機(jī)能試驗(yàn)系統(tǒng)檢測右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure，RVSP)［4］，間接反應(yīng)肺動(dòng)脈壓力值。

1．4 大鼠血漿MPs檢測

測量肺動(dòng)脈壓力后經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，然后依文獻(xiàn)［6］的兩步法提取MPs:第一步離心(4℃ 11 000×g 2 min)得到乏血小板血漿，然后取2 ml乏血小板血漿進(jìn)行第二步離心(4℃ 13 000×g 45 min)，結(jié)束后吸去上清，在用100 μl RPMI1640培養(yǎng)基重懸MPs。用BCA試劑盒測定MPs蛋白濃度。

1．5 MPs對(duì)大鼠肺血管eNOS蛋白的影響

取6只大鼠分別開胸取肺動(dòng)脈并小心去除動(dòng)脈周圍組織，將肺動(dòng)脈剖開放入RPMI1640培養(yǎng)基內(nèi)平衡1 h，然后分別加入等量的三組MPs(1 mg/ml)刺激1 h。刺激結(jié)束后將肺血管用PBS清洗3次并吸干多余PBS后移入液氮內(nèi)速凍5 min，將速凍的肺血管研磨破碎后用RIPA裂解液在冰上裂解10 min。10 min后離心(4℃ 10 000×g 30 min)并吸取上層蛋白。用BCA試劑盒測定蛋白濃度。提取蛋白通過Western blot檢測eNOS蛋白的表達(dá)變化。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2．1 大鼠肺動(dòng)脈壓力測定

各組大鼠 RVSP測量結(jié)果的比較:與對(duì)照組［(11．26 ±2．43 mmHg)］比較，MCT 組［(24．71 ±2．51 mmHg)］大鼠肺動(dòng)脈壓力升高，提示PH建模成功;L-Arg組大鼠的肺動(dòng)脈壓力［(18．15±2．27)mmHg］較MCT組低說明L-Arg緩解了PH病情。

2．2 大鼠血漿MPs含量檢測

與對(duì)照組［(1．14±0．53 mg/ml)］相比，MCT 組大鼠體內(nèi) MPs濃度明顯升高［(2．02±0．33)mg/ml］;L-Arg一定程度上降低了PH大鼠體內(nèi)的MPs濃度［(1．64 ±0．31)mg/ml］。

2．3 MPs對(duì)大鼠肺血管eNOS蛋白影響

與對(duì)照組比較，MCT組和L-Arg組eNOS蛋白的表達(dá)均降低，而且MCT組與L-Arg組eNOS蛋白的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見圖1)。

圖1 各組大鼠MPs對(duì)eNOS蛋白表達(dá)的影響Figure 1 Effect of MPs on the expression of eNOS protein in rats

3 討論

肺血管內(nèi)皮位于肺血管腔的內(nèi)表面，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞通過分泌各種收縮和舒張因子維持肺動(dòng)脈壓力的穩(wěn)定，當(dāng)細(xì)胞受到不同炎癥因子或病毒的刺激、接觸某些藥物、組織細(xì)胞缺氧、受到血流剪切力等作用時(shí)，肺血管內(nèi)皮組織均會(huì)受損［7］。

一氧化氮(nitric oxide，NO)是重要的血管內(nèi)皮依賴舒張因子。內(nèi)皮細(xì)胞以L-Arg為底物依靠eNOS合成NO促進(jìn)血管舒張，維持肺動(dòng)脈壓力保持在正常水平。我們［2］和其他研究團(tuán)隊(duì)［3，8］表明:LArg通過上調(diào)eNOS蛋白的表達(dá)、抑制血小板的聚集、減少內(nèi)皮素－1的產(chǎn)生、促進(jìn)血管舒張，以緩解肺高壓。

內(nèi)皮細(xì)胞被激活或發(fā)生凋亡時(shí)會(huì)以胞膜出芽的形式向周圍的環(huán)境中分泌細(xì)胞MPs［9］。研究發(fā)現(xiàn)MPs大小為 0．1－1．0 μm，是亞微米級(jí)的細(xì)胞顆粒［10，11］。除內(nèi)皮細(xì)胞外，血小板也可以生成 MPs。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)MPs含量反映內(nèi)皮損傷和功能障礙［5－8］。Ci等［4］報(bào)道 EMPs可以減少瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞eNOS蛋白的表達(dá)和減少 NO的產(chǎn)生;同時(shí)EMPs還通過抑制熱休克蛋白90(HSP90)和eNOS的結(jié)合而減少NO的生成和增加氧自由基的產(chǎn)生。我們最近的研究顯示:MPs通過抑制eNOS蛋白和上調(diào)彈性蛋白而加重肺高壓［12］。L-Arg是否是通過作用于MPs來緩解肺高壓目前尚無報(bào)道，這也正是我們這次研究的重點(diǎn)。

本研究顯示:L-Arg可以減少PH大鼠體內(nèi)增高的MPs，但是L-Arg并沒有減輕MPs對(duì)離體肺血管中eNOS的蛋白表達(dá)的下調(diào)作用。這一結(jié)果說明MPs通過抑制肺動(dòng)脈血管eNOS的上調(diào)而加重肺高壓;L-Arg通過為肺動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞提供NO底物改善肺高壓而減少M(fèi)Ps的數(shù)量來緩解MPs對(duì)肺高壓的加重，但是L-Arg并沒有影響MPs的質(zhì)量。

綜上所述，PH時(shí)MPs升高，后者損害肺血管eNOS蛋白表達(dá)而進(jìn)一步惡化PH，即:PH→MPs升高→eNOS下降→內(nèi)皮功能受損→PH升高的惡性循環(huán)。L-Arg通過緩解肺高壓降低了MPs含量而減輕MPs對(duì)肺高壓的損害，即:L-Arg→PH降低→MPs數(shù)量減少→PH下降的循環(huán)。但是L-Arg并沒有影響MPs本身對(duì)肺血管內(nèi)皮的損害。我們的研究進(jìn)一步闡明了L-Arg防治PH的機(jī)制，為今后將L-Arg作為防治PH的臨床藥物提供理論依據(jù)。

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