聚桂醇液在兔胃壁組織中硬化病理過程的觀察研究

司徒光偉 周珞華 孫遠(yuǎn)昌 屈 兵 陳小路 高 翼

(1湖北省武漢第八醫(yī)院武漢肛腸醫(yī)院;2武漢鋼鐵總公司職工總醫(yī)院肛腸外科;3武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，武漢市 430008)

硬化劑作為治療痔的一種療法已經(jīng)使用多年，種類較多。乙氧硬化醇其商品名稱為聚桂醇注射液，屬于聚氧乙烯月桂醇醚類化合物，作為一種新型硬化劑，已批準(zhǔn)上市并在血管科和消化科廣泛應(yīng)用，其在血管壁上可以瞬間產(chǎn)生硬化作用，從而閉塞血管;但其在黏膜組織中的硬化過程還需要進(jìn)一步的經(jīng)過動物實驗驗證。本實驗將聚桂醇注射液注射在兔胃壁組織間，一定時間后切取胃壁組織，觀察胃壁組織的病理變化，從而明確硬化劑在黏膜組織中的硬化病理過程，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 試驗對象和材料

1．1 試驗藥品 聚桂醇注射液，化學(xué)名:聚氧乙烯月桂醇醚;分子式:C12H25(OCH2CH2)Noh(n=9);分子量:582．8。由陜西天宇制藥有限公司提供原液為1%、3%兩種濃度聚桂醇液。

1．2 實驗動物 武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司實驗動物室提供的健康成年日本大耳白兔80只，普通級，雌雄隨機(jī)，雌兔未孕，分別稱重并編號，體重1．8 ～2．0 kg。

1．3 麻醉藥品 依托咪酯注射液(恩華制藥股份有限公司)，規(guī)格為20 mg:10 mL。枸櫞酸芬太尼注射液(宜昌人福制藥有限公司)，規(guī)格為0．1 mg:2 mL。

1．4 地點 武漢科技大學(xué)動物實驗中心

2 試驗設(shè)計思路及要求

根據(jù)不同原液濃度聚桂醇注射液，將試驗組分成1%組為F組和3%組為H組。在規(guī)定時間內(nèi)完成活體標(biāo)本制作并記錄標(biāo)本制作時間，每組完成40例標(biāo)本并作組別記號，同樣劑量做兩只標(biāo)本以便死亡備用。制作完成后將活兔放入飼養(yǎng)籠飼養(yǎng)。設(shè)定在術(shù)后24 h取出已標(biāo)記標(biāo)本，并于每24 h取1只制作標(biāo)本1個，直到取完為止。每一個被取標(biāo)本，在取出后放置到已對應(yīng)標(biāo)記好的標(biāo)本瓶中，用10%福爾馬林液固定，送病理組取材制片。將病理切片在40倍、100倍和400倍鏡下觀察病理組織變化，并作定性定量分析。

3 試驗步驟

3．1 麻醉管理 ①麻醉方式:靜脈全身麻醉;②注藥部位:耳緣靜脈頭皮針穿刺;③用藥劑量和方法:依托咪酯0．5 mg/kg、20 ～30 s內(nèi)注完，芬太尼5 μg/kg、20 s注完，8 min后如手術(shù)尚未結(jié)束則追加依托咪酯0．5 mg/kg;④蘇醒時間:術(shù)畢1～8 min;⑤注意事項:依托咪酯呼吸、循環(huán)影響小，故可用于保留自主呼吸的麻醉，但無鎮(zhèn)痛作用，故需追加一定劑量的阿片類鎮(zhèn)痛藥;芬太尼作用時間為20～40 min，適合短時間手術(shù)麻醉;目前尚無與依托咪酯混合注射的臨床研究，故需分別用藥。

3．2 標(biāo)本制作方法 ①麻醉后，將兔上腹部毛發(fā)剃凈，取正中切口，切開腹壁進(jìn)入腹腔;②將兔胃壁提起，在前壁正中肌層組織與漿膜層間注射規(guī)定濃度原液0．5 mL，原液中每10 mL加入1 mL美藍(lán)注射液;③每個注射原液的胃壁均可見1．0 cm×1．0 cm大小浸潤灶，在注射灶兩端約0．5 cm處分別用細(xì)絲線縫合打結(jié)標(biāo)記;④全層縫合腹壁，在兔耳上作組別標(biāo)記。

3．3 取材 ①在設(shè)定時間，將已制作完成的兔從飼養(yǎng)籠中取出，在心前區(qū)注射2 mL空氣后標(biāo)本兔死亡;②切開腹壁原切口，將胃組織提起，在前壁出，將已標(biāo)記的部位胃壁組織全層完整切除;③將切除標(biāo)本放入與之同標(biāo)記號的10%福爾馬林瓶中。

3．4 病理取材 取絲線標(biāo)記組織，去除周圍多余組織，于組織中央部位切片，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色。

3．5 觀察指標(biāo) ①大體觀察;②成纖維細(xì)胞數(shù)密度:400倍光鏡下觀察HE染色切片，每個標(biāo)本隨機(jī)選5個視野(0．005 2 mm2/視野)，目測計數(shù)并計數(shù)切片內(nèi)單位面積成纖維細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果取均數(shù)。

4 結(jié)果

4．1 病理及成纖維細(xì)胞 實驗早期，因溫度、濕度控制不當(dāng)及飼料問題導(dǎo)致實驗動物死亡5只，因術(shù)后切口感染死亡2只。除去預(yù)計的死亡因素及其他不可控因素外，將實驗觀察時間均確定在21 d。大體觀察:標(biāo)記處組織顏色稍深，呈淡藍(lán)色，質(zhì)地較硬，隨時間推移，有較明顯的丘狀隆起，略高出于漿膜。每張標(biāo)本的病理報告和成纖維細(xì)胞計數(shù)。詳見表1。

表1 病理報告及成纖維細(xì)胞計數(shù)

4．2 成纖維細(xì)胞狀態(tài) 成纖維細(xì)胞數(shù)密度分布見圖1、 圖2;兩組數(shù)字統(tǒng)計學(xué)處理見表2。

圖1 H組成纖維細(xì)胞密度

圖2 F組成纖維細(xì)胞密度

表2 兩組成纖維細(xì)胞密度均數(shù)

4．3 主要病理變化 出現(xiàn)反應(yīng)的時間及病理變化:F組在第5天開始可見漿膜有炎癥反應(yīng)并有著色較深的成纖維細(xì)胞增生，成纖維細(xì)胞胞體較大，毛細(xì)血管生成較多，血管內(nèi)皮細(xì)胞肥大;成纖維細(xì)胞數(shù)量第6天達(dá)高峰，以后逐漸減少，同時纖維細(xì)胞逐漸增多，膠原纖維也逐漸增多，第12天大量形成膠原纖維。F組典型時間病理圖片見圖3～圖10。H組在第3天黏膜下見出血、水腫、有炎癥細(xì)胞浸潤，有少量成纖維細(xì)胞增生，毛細(xì)血管增多。成纖維細(xì)胞逐漸增多，到第4天達(dá)最高峰，以后逐漸減少;同時膠原纖維逐漸增多，第8天以后，成纖維細(xì)胞逐漸減少，變成纖維細(xì)胞，膠原纖維平穩(wěn)增加。H組典型時間病理圖片見圖11～圖17。

圖3 F組第5天HE×40

圖4 F組第5天，HE×100

圖5 F組第5天，HE×400

圖6 F組第17天HE×40

圖7 F組第17天，HE×100

圖8 F組第17天，HE×400

圖9 F組第20天，HE×40

圖10 F組第20天，HE×100

圖10 F組第20天，HE×400

圖12 H組第3天HE×40

圖13 H組第3天，HE×100

圖14 H組第3天HE×400

圖15 H組第18天HE×40

圖16 H組第18天HE×100

圖17 H組第18天HE×400

5 討論

聚桂醇原液被認(rèn)為有致組織硬化作用。根據(jù)其硬化原理，其制劑已廣泛應(yīng)用于臨床治療，如治療食管下端、胃底曲癥或破裂急性出血、下肢靜脈曲張癥等，這些治療效果已被充分地臨床驗證［1～3］。在這些臨床治療中一般是將聚桂醇液體注入到管腔內(nèi)，其主要病理原理為:聚桂醇為一種兩性分子，液態(tài)時聚集成膠體束，一旦與細(xì)胞表面膜脂相互作用即可發(fā)生細(xì)胞損傷［4］。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后迅速啟動凝血反應(yīng)，同時伴有大量膠原纖維形成，在局部形成團(tuán)塊狀凝聚，致硬化形成［5］。

聚桂醇液注射在黏膜組織中是否會形成硬化現(xiàn)象與在腔內(nèi)硬化過程是否一致?我們將兔分成兩組，選取其胃壁組織作為觀察載體，按照設(shè)計思路，在注射完成后，保證實驗兔一定成活，并在規(guī)定的時間內(nèi)按時去取出標(biāo)本。

在取出的標(biāo)本中首先觀察組織中與聚桂醇集中的部位里組織結(jié)構(gòu)的變化。兩組中，注射第5天和第3天開始出現(xiàn)炎性反應(yīng)和成纖維細(xì)胞出現(xiàn)，明顯與藥物濃度有相關(guān)性。出現(xiàn)成纖維細(xì)胞的第2天開始，都有成纖維細(xì)胞計數(shù)突然猛增的過程，其后1周左右出現(xiàn)成纖維細(xì)胞數(shù)逐漸減少，在10 d后細(xì)胞數(shù)保持平穩(wěn)狀態(tài)。隨著成纖維細(xì)胞出現(xiàn)，開始有少量膠原纖維成分出現(xiàn)，與細(xì)胞數(shù)量多少無明顯關(guān)系。約10 d后，在成纖維細(xì)胞增加不明顯的時候，膠原纖維成分在逐漸增多。15 d后膠原纖維成分多量產(chǎn)生，并增粗呈緊密排列現(xiàn)象。炎性反應(yīng)逐漸降低。在膠原纖維產(chǎn)生過程中，組織中的血管閉合及萎縮，無壞死現(xiàn)象發(fā)生。這組病理現(xiàn)象與在其他組織中發(fā)生的反應(yīng)相一致［6］。

在注射過聚桂醇的組織中，20 d內(nèi)完成了一次完整的炎性反應(yīng)過程，在產(chǎn)生大量膠原纖維后，壓迫局部血管，導(dǎo)致局部血液循環(huán)成分減少，組織機(jī)化，局部組織變硬卻又不發(fā)生壞死。這個病理現(xiàn)象，說明聚桂醇液在黏膜組織中也可以產(chǎn)生明顯機(jī)化的硬化反應(yīng)。痔的治療時，是將硬化劑注入到痔核組織中，有完整的黏膜層結(jié)構(gòu)，因黏膜組織機(jī)化后可導(dǎo)致痔體萎縮。如果注射到食管下段黏膜組織中，同樣因為組織機(jī)化壓迫曲張的靜脈達(dá)到止血目的。

實驗過程中對兩種不同濃度原液做對照觀察。鏡下所見整個硬化過程與藥物濃度無關(guān)，有一定時間關(guān)系，濃度高者出現(xiàn)硬化時間稍早。在整個硬化過程中，在組織中出現(xiàn)的時間一般在注射后3～5 d開始，7～10 d組織開始硬化，15 d后硬化過程才完成。在組織中的硬化時間與血管腔內(nèi)發(fā)生硬化的時間有明顯差異。由于硬化發(fā)生時必須要有成纖維細(xì)胞增殖，組織中的成纖維細(xì)胞來自于組織中靜止的纖維細(xì)胞和未分化間充質(zhì)細(xì)胞，因而硬化時間一定慢于在血管中的時間。

［1］ 崔世軍，張 建，谷涌泉，等．聚桂醇400治療下肢靜脈曲張療效和安全性的臨床研究［J］．藥物不良反應(yīng)雜志2010，12(4):234 －239．

［2］ 羅顯克，王大東，譚建榮．內(nèi)鏡下注射聚桂醇硬化劑治療食管靜脈曲張28例分析［J］．微創(chuàng)醫(yī)學(xué)2010，5(6):586－587．

［3］ 劉小平，杜 昕．泡沫硬化劑與其治療下肢靜脈曲張的臨床應(yīng)用進(jìn)展［J］．中國血管外科雜志(電子版)，2010，2(1):67－68．

［4］ Zimmet SE．Sclerotherapy treatment of telangiectasias and varicose veins［J］．Tech Vase Interv Radiol，2003，6(3):116－120．

［5］ Coleridge Smith P．Foam and liquid sderoherapy for varicose veins［J］．Phlebology，2009，24(Suppl 1):62 －72．

［6］ 王延蜀，劉 宇，吳美娟，等．聚桂醇注射兔面部腮腺區(qū)組織的實驗研究［J］．實用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2012，28(4):453－456．