針刺對肥胖大鼠Lee’s指數(shù)、胰島素、瘦素和SOCS 3水平的影響▲

唐紅珍 蔣凌風(fēng) 陳丹丹 梁 媚 黃鴻騰 張昭陽 劉 佳

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧市 530001)

單純性肥胖病是由于機(jī)體能量攝入超過消耗，導(dǎo)致體內(nèi)脂肪積聚過多的一種病理狀態(tài)［1］。肥胖可以導(dǎo)致多種危險(xiǎn)性病癥，如冠心病、高血壓、高脂血癥、2型糖尿病、腦卒中等［1，2］，嚴(yán)重影響人類健康。因此，預(yù)防和治療肥胖已成為全球重大的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國體重超重的比例達(dá) 22．4% ，肥胖者為 3．01%［3，4］。關(guān)于肥胖的治療，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚缺乏特別有效的策略及干預(yù)措施，近年采用傳統(tǒng)中醫(yī)藥方法治療取得了顯著效果，特別是針刺減肥以其療效顯著、無毒副作用而成為臨床最為普遍的治療選擇之一［5］。一些研究已闡釋了中醫(yī)針刺減肥具有多層次、多靶點(diǎn)干預(yù)效應(yīng)［6，7］，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。在肥胖發(fā)病機(jī)制研究中，胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)及瘦素抵抗(Leptin resistance，LR)作為肥胖發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素已被廣泛認(rèn)可［8～10］。IR和LR存在著共同調(diào)節(jié)關(guān)鍵點(diǎn):細(xì)胞因子信號(hào)抑制劑3(Suppressor of cytokinesignaling-3，SOCS3)，可通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制調(diào)節(jié)體內(nèi)胰島素、瘦素水平。本研究探討針刺對肥胖大鼠血清瘦素、胰島素和SOCS3水平的影響，以期闡釋針灸減肥的作用機(jī)制，為針刺治療肥胖病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料及方法

1．1 材料與試劑

1．1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級健康雄性SD大鼠70只，體重180～210 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供［許可證號(hào):SCXK(湘)2013-0004］。

1．1．2 飼料配制

1．1．2．1 普通飼料 由廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。營養(yǎng)成分符合GB/T14924．10-2001標(biāo)準(zhǔn)，具體營養(yǎng)成分指標(biāo)為:水分10%，粗蛋白質(zhì)18%，粗脂肪4%，粗纖維5%，粗灰分8%，鈣1．0% ～1．8%，鈣:磷比為1．2 ∶1 ～1．7 ∶1。

1．1．2．2 高脂飼料(配比) 豬油10%，全脂奶粉3%，白糖5%，雞蛋5%，膽固醇1%，豬膽酸0．25%，其余為普通飼料。

1．1．3 主要試劑和儀器 大鼠瘦素(LEP)測試盒、細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(SOCS3)ELISA試劑盒(南京建成科技有限公司);大鼠胰島素(Insulin)測試盒(武漢博士德生物工程有限公司);針具選蘇州產(chǎn)掀針，規(guī)格0．22 mm ×1．5 mm。

1．1．4 主要儀器 全波長酶標(biāo)儀:EPOCH BIOTEK(編號(hào):20110793);eppendorf離心機(jī)。

1．2 方法

1．2．1 動(dòng)物造模方法 70只SD大鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按1∶6的比例隨機(jī)分為普通飼料組(10只)、高脂飼料組(60只)，普通飼料組喂食普通飼料，高脂飲食組喂食高脂飼料，兩組均連續(xù)喂養(yǎng)6周。高脂飲食60只大鼠中，有47只大鼠體重超過普通飲食組大鼠平均體重20%以上，達(dá)到模型復(fù)制要求［11］。

1．2．2 大鼠分組及針灸干預(yù)方法 以普通飼料喂養(yǎng)的10只大鼠作為空白對照組，從符合模型標(biāo)準(zhǔn)的47只大鼠中選擇體重相近大鼠30只，隨機(jī)分為:①特定穴位針刺組(10只):取中脘、關(guān)元、足三里(雙側(cè))、天樞(雙側(cè))、豐隆(雙側(cè))、陰陵泉(雙側(cè))，刺入深度3～5 mm;②非特定穴位針刺組(10只):取上穴旁開0．5寸非經(jīng)非穴處進(jìn)行針刺，留針30 min，1次/d;③模型對照組(10只):模型對照組實(shí)行等時(shí)(與干預(yù)組相同時(shí)間)捆綁固定;④空白對照組(10只):給予常規(guī)飼養(yǎng)，不行針刺或捆綁干預(yù)。

1．2．3 飼養(yǎng)條件 所有大鼠在飼養(yǎng)過程中，飼養(yǎng)室溫(22±1)℃，空氣濕度(50% ±4．7%)，自由飲水，不限制飼料量，12/12晝夜循環(huán)，干預(yù)4周。

1．3 觀測指標(biāo)及方法 期間每周檢測記錄所有大鼠體重、體長、Lee’s指數(shù)。治療后，麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血分離血清，采用酶聯(lián)免疫法檢測血清相關(guān)指標(biāo)(所有測定步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作)。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 15．0軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，干預(yù)前后比較采用配對 t檢驗(yàn)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 動(dòng)物模型制備 動(dòng)物分組時(shí)，普通飼料組與高脂飲食組大鼠體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05);經(jīng)過6周飲食誘導(dǎo)后，高脂飲食組大鼠體重明顯重于普通飼料組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，其中高脂飲食組大鼠體重超過普通飲食組平均體重20%的大鼠共47只。肥胖誘導(dǎo)大鼠模型達(dá)到實(shí)驗(yàn)預(yù)期目標(biāo)，模型復(fù)制成功。見表1。

表1 不同飼料誘導(dǎo)大鼠體重比較

2．2 針刺干預(yù)對大鼠體重的影響 各組在實(shí)驗(yàn)第0周(造模前)，體重?zé)o明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05)，實(shí)驗(yàn)第6周(造模結(jié)束)階段，模型對照組、特定穴針刺組、非特定穴針刺組體重均顯著高于空白對照組(P＜0．01)，但三組之間比較，無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05)，經(jīng)過連續(xù)5周的干預(yù)處理后，特定穴位針刺組、非特定穴位針刺組體重明顯高于模型對照組(P＜0．01)，且特定穴位針刺組體重明顯高于非特定穴位針刺組(P＜0．05)。見表2。

表2 不同組大鼠干預(yù)前后體重比較

2．3 針刺對大鼠Lee’s指數(shù)的影響 第6周造模結(jié)束時(shí)，模型對照組、特定穴位針刺組、非特定穴位針刺組大鼠Lee’s指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05);經(jīng)過4周的干預(yù)處理后，特定穴位針刺組和非特定穴位針刺組大鼠Lee’s指數(shù)明顯低于模型對照組(P＜0．01)，且特定穴位針刺組明顯低于非特定穴位針刺組(P ＜0．05)。見表3。

2．4 大鼠血清胰島素、瘦素、SOCS3含量 模型對照組的血清胰島素、瘦素及SOCS3含量與空白對照組比較均有顯著升高(P＜0．05)，提示高脂飼料誘導(dǎo)的肥胖大鼠胰島素、瘦素及SOCS3含量，存在胰島素、瘦素抵抗;而針刺治療后，非特針組、特針組大鼠的血清胰島素、瘦素及SOCS3含量與模型對照組對比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，提示針刺能緩解肥胖大鼠高瘦素血癥、高胰島素血癥，并可能與SOCS3調(diào)控有關(guān)。見表3。

表3 針刺對大鼠Lee’s指數(shù)胰島素、瘦素和SOCS3的影響 (n=10)

3 討論

肥胖是體內(nèi)脂肪堆積過多和(或)分布異常的一種狀態(tài)。單純性肥胖(以下簡稱肥胖)是指無明顯內(nèi)分泌代謝疾病等病因可尋的肥胖癥，約占所有肥胖病的95%以上。鑒于飲食富營養(yǎng)化是肥胖形成的主要病因，現(xiàn)階段最常研究的肥胖動(dòng)物模型是營養(yǎng)型肥胖大鼠模型，因與人類高脂飲食引起的肥胖有許多相似特征，所以被廣泛應(yīng)用于肥胖和減肥藥的實(shí)驗(yàn)研究［12，13］，本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)模仿人體肥胖病因，通過該方法復(fù)制肥胖模型。研究通常以體重指數(shù)(BMI)作為衡量人體肥胖的指標(biāo)，而大鼠則常用Lee’s指數(shù)衡量肥胖度。本實(shí)驗(yàn)檢測了大鼠體重、Lee’s指數(shù)，研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過連續(xù)7周的高脂飲食喂養(yǎng)后，高脂飲食組大鼠體重、Lee’s指數(shù)等明顯高于普通飲食組大鼠，與楊曉姣等［14］研究結(jié)果類似，最后選擇體重超過正常大鼠體重20%者為肥胖模型對照組大鼠，達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。

在肥胖的發(fā)病機(jī)制中，瘦素是肥胖基因(obese gene)表達(dá)產(chǎn)物，具有抑制食欲、減少食物攝入、增加能量消耗的作用，使機(jī)體不至于過度肥胖［15，16］。但研究表明大多數(shù)肥胖者和嚙齒類動(dòng)物中血清瘦素不但不降低反而表現(xiàn)為高瘦素血癥［17，18］，血清中瘦素水平與肥胖程度呈正相關(guān)，提示瘦素與肥胖癥發(fā)病密切相關(guān)，瘦素不能正常發(fā)揮其減輕體重的作用，其對瘦素的反應(yīng)減弱或無反應(yīng)而呈現(xiàn)明顯的瘦素抵抗現(xiàn)象。在老齡鼠中，高瘦素血癥可使SOCS-3濃度升高達(dá)幼鼠的3倍，使瘦素抵抗增加，脂肪含量增加1．5倍［19］。而瘦素又能抑制胰島素表達(dá)、分泌，同時(shí)瘦素對脂肪分解作用本身也加重了胰島素抵抗，特別是肥胖患者體內(nèi)高胰島素血癥引起高瘦素血癥，加劇了胰島素抵抗，最終可導(dǎo)致瘦素抵抗［20］。

SOCS3是由3個(gè)研究小組分別采用不同方法發(fā)現(xiàn)的，也稱為細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子，他主要通過抑制JAK/STAT通路對細(xì)胞因子進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)，被稱為細(xì)胞的“分子剎車”。SOCS3屬于SOCS家族，與肥胖、2型糖尿病等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。SOCS3可以調(diào)節(jié)中樞瘦素敏感性，瘦素誘導(dǎo)SOCS3的表達(dá)，而SOCS3又可作為瘦素信號(hào)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。同時(shí)，SOCS3還參與了多種狀態(tài)下及多種激素或大分子引起的胰島素抵抗的形成過程。Lebrun等［21］認(rèn)為，SOCS3蛋白是通過以下機(jī)制抑制胰島素信號(hào)通路的:①通過競爭IR上的作用位點(diǎn)而抑制IRS的酪氨酸磷酸化;②通過SOCS盒靶向作用結(jié)合IRS并使之泛素化，從而易于被蛋白酶體識(shí)別和降解，降低IRS水平，影響胰島素信號(hào)傳導(dǎo);③抑制胰島素受體酪氨酸激酶的活性。

綜上可見，SOCS3蛋白可以抑制瘦素和胰島素的信號(hào)通路，影響能量平衡和葡萄糖內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，與肥胖的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系。針刺是治療肥胖的有效手段之一，大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)［22，23］針刺有良好減肥療效的同時(shí)，還能減少胰島素含量，因此，我們認(rèn)為，針刺有可能通過SOCS3的變化來影響胰島素抵抗和瘦素抵抗。這一問題也是本研究亟需通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的關(guān)鍵問題。

課題組前期采用固本培元、健脾和胃法選穴治療肥胖發(fā)現(xiàn)，超重及肥胖者經(jīng)針刺治療后，腹腰圍、大腿圍明顯減少、體重明顯減輕，總有效率達(dá)到86．7%，且具有起效時(shí)間快、安全性高等優(yōu)勢［24，25］。故選擇足三里、中脘、天樞、豐隆、陰陵泉、關(guān)元等穴位作為治療肥胖的配方，方中足三里為胃經(jīng)合穴，是治療脾胃病主穴;天樞居于臍旁，是大腸募穴，通于中焦，兩穴合用有斡旋上下、司升降之功;豐隆是足陽明胃經(jīng)之絡(luò)穴，絡(luò)于足太陰脾經(jīng)，具有健脾化濕之功，是治痰要穴。關(guān)元位于下焦，為任脈穴、小腸募穴，小腸主精微吸收功能，是脾主運(yùn)化和升清功能實(shí)現(xiàn)的重要體現(xiàn)。關(guān)元系三陰與任脈之會(huì)穴，可調(diào)節(jié)肝、脾、腎以及任脈的功能，且具有補(bǔ)益下焦之氣的功用。陰陵泉可調(diào)真元，通利三焦，清利小便。以上諸穴相配，表里同治，標(biāo)本兼顧，既可促進(jìn)脾升胃降，又可補(bǔ)氣助陽益腎，推動(dòng)全身氣機(jī)運(yùn)行，促使氣充體旺，痰化濁去，達(dá)到消脂減肥之目的。

本研究顯示:高脂飼料誘導(dǎo)的肥胖大鼠血清瘦素、胰島素及SOCS3含量升高，與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與相關(guān)報(bào)道一致［26，27］，驗(yàn)證了肥胖癥存在胰島素抵抗及瘦素抵抗。而經(jīng)治療后，特針組、非特針組大鼠體重與模型對照組對比顯著下降，瘦素、胰島素及SOCS3較模型對照組亦有顯著下降;而特針組的胰島素、SOCS3含量較非特針組下降更顯著，該結(jié)果提示，針刺能減體重、降Lee’s指數(shù)，還能緩解胰島素、瘦素抵抗，對肥胖癥有治療和預(yù)防作用;而SOCS3作為JAK/STAT通路的主要負(fù)性調(diào)節(jié)因子，與JAK2結(jié)合抑制其和瘦素受體的酪氨酸磷酸化，從而阻止了瘦素信號(hào)沿著 JAK/STAT通路的傳導(dǎo)，經(jīng)針刺后SOCS3含量減低，提示其可能參與調(diào)節(jié)JAK/STAT通路從而改善瘦素抵抗。

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