抗菌肽在飼用枯草芽孢桿菌中表達(dá)的研究進(jìn)展

李連彬，陳秀麗

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.陜西省漢中市動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，陜西漢中 723100）

由于抗生素藥物的濫用，出現(xiàn)了越來越多的抗生素耐藥菌株，傳統(tǒng)抗生素替代藥物的開發(fā)已成為目前研究熱點(diǎn)。在生物機(jī)體中分離出的抗菌肽被認(rèn)為是一種最有潛力的抗菌類藥物。抗菌肽一般含有10～50個(gè)氨基酸，整體帶有2～9個(gè)的正電荷，較大部分（≥30%）的疏水性氨基酸（Hancock和Sahl，2006）?？咕木哂锌咕V廣、抗菌活性高、不易產(chǎn)生耐藥性、無毒副作用 （僅少數(shù)種類具有溶血活性）、無殘留與無污染等優(yōu)點(diǎn)，符合畜產(chǎn)品安全生產(chǎn)的需要，適合在飼料生產(chǎn)中使用，具有作為新一代飼料添加劑的潛質(zhì)（單安山等，2012）。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是廣泛存在于土壤和動(dòng)物胃腸道的一類革蘭氏陽(yáng)性菌，目前已作為重要的工業(yè)菌種被越來越多地應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中?？莶菅挎邨U菌具有易于分離培養(yǎng)、較清晰的遺傳背景、良好的分泌性及無致病性等優(yōu)點(diǎn)。近幾年來利用重組枯草芽孢桿菌生產(chǎn)飼用酶、飼用活性代謝產(chǎn)物以及作為腸道益生菌成為熱點(diǎn)研究領(lǐng)域。本文對(duì)枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)及抗菌肽在其中的表達(dá)進(jìn)行了簡(jiǎn)要的綜述，以期為開發(fā)飼用型抗菌制劑提供參考。

1 枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)

枯草芽孢桿菌屬于芽孢桿菌屬，是一類好氧型、內(nèi)生抗逆性孢子的革蘭氏陽(yáng)性菌。其細(xì)胞呈直桿狀，大小為（0.8 ～ 1.2）μm×（1.5 ～ 4.0）μm，廣泛分布于土壤及腐敗的有機(jī)物中。因其培養(yǎng)簡(jiǎn)單快速，具有較強(qiáng)的分泌蛋白質(zhì)的能力、非致病性及良好的發(fā)酵基礎(chǔ)和生產(chǎn)技術(shù)，故枯草芽孢桿菌是目前生產(chǎn)各種工業(yè)用酶，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等的理想表達(dá)宿主，是微生物研究領(lǐng)域中的一種重要模式菌株。

枯草芽孢桿菌具有自己獨(dú)特的生長(zhǎng)規(guī)律：生長(zhǎng)延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期及芽孢發(fā)育期。其在不同的生長(zhǎng)階段基因表達(dá)不同，有多種不同時(shí)序性的 σ因子來調(diào)節(jié) （Staroń等，2009）。 楊明明（2013）利用電轉(zhuǎn)化介導(dǎo)枯草芽孢桿菌早期生孢基因的敲除，獲得了枯草芽孢桿菌生孢基因缺失株B.subtilis GJ09?？莶菅挎邨U菌表達(dá)系統(tǒng)的另一個(gè)特點(diǎn)是其能將蛋白大量分泌至培養(yǎng)基中，通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，枯草芽孢桿菌共有294種外分泌型蛋白。但是由于其胞外蛋白酶表達(dá)量大反而容易引起目標(biāo)蛋白的降解，目前通常的解決方法是采用蛋白酶缺陷株作為宿主（Nijland 和 Kuipers，2008）。

雖然與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相比枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)更適合應(yīng)用到制備飼用酶及抗菌制劑中，但是其嵌合載體拷貝數(shù)低、啟動(dòng)子活性低，導(dǎo)致目標(biāo)基因表達(dá)量低等問題。近幾年的研究主要圍繞著如何構(gòu)建高拷貝的載體、篩選高活性的啟動(dòng)子等內(nèi)容。

1.1 枯草芽孢桿菌載體系統(tǒng) 在微生物的遺傳操作中，質(zhì)粒載體是基因重組技術(shù)中的重要工具。然而大部分枯草芽孢桿菌不含內(nèi)源性質(zhì)粒。目前常用的質(zhì)粒一般來源于葡萄球菌和鏈球菌，其中應(yīng)用效果較好的是采用滾環(huán)型復(fù)制的小型質(zhì)粒。但是質(zhì)粒仍然存在分離不穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定等問題（Tanaka等，2010）。這嚴(yán)重影響了其在枯草芽孢桿菌的研究應(yīng)用，此外在枯草芽孢桿菌的遺傳操作中，體外連接的雙鏈質(zhì)粒DNA分子直接轉(zhuǎn)化宿主效率極低。許多基因不能直接構(gòu)建枯草芽孢桿菌質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)入宿主菌進(jìn)行表達(dá)。然而，大腸桿菌分子遺傳操作成熟，不會(huì)產(chǎn)生質(zhì)粒不穩(wěn)定性現(xiàn)象，因此可以將外源基因在大腸桿菌中構(gòu)建完成后再轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌中表達(dá)。故構(gòu)建大腸桿菌-枯草芽孢桿菌的穿梭質(zhì)粒載體是十分必要，目前常用的穿梭質(zhì)粒載體有 pEB10、pEB20、pEB60、pUB18、pUB19 和 pWB980，還有能夠?qū)崿F(xiàn)在枯草芽孢桿菌中高效表達(dá)的pHT01和pHT43（余小霞等，2015；Nguyen 等，2007）。 李瑞芳等（2006）用大腸桿菌質(zhì)粒pSP72和枯草桿菌質(zhì)粒Pub18共整合得到雙功能克隆載體pSB。楊明明（2013）從質(zhì)粒的大小、多克隆位點(diǎn)的合理布局、抗性標(biāo)記的便利性、質(zhì)粒提取的便利性以及復(fù)制子特性等角度出發(fā)，構(gòu)建了新的結(jié)構(gòu)緊湊的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體pGJ03及pGJ148。

1.2 枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的啟動(dòng)子 啟動(dòng)子是位于結(jié)構(gòu)基因 5'端上游的 DNA序列，能夠活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準(zhǔn)確的結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。獲得高活性的啟動(dòng)子是實(shí)現(xiàn)外源基因高效表達(dá)的關(guān)鍵。在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中常用的啟動(dòng)子主要分為2個(gè)類型：組成型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子即持續(xù)性表達(dá)蛋白的啟動(dòng)子，如P43啟動(dòng)子（Chiang等，2010）。這類啟動(dòng)子啟動(dòng)強(qiáng)度通常要求較強(qiáng)，且成本低，一些組成型啟動(dòng)子常通過構(gòu)建胞內(nèi)或分泌表達(dá)載體表達(dá)目的蛋白，但存在對(duì)宿主生長(zhǎng)有害的蛋白難以表達(dá)和可控性差的缺陷 （Ying等，2011）。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以根據(jù)需要調(diào)控基因的表達(dá)。常用的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子主要有4類：Pspac、Pxyl、PsacB和Pglv。Pspac由SPO1的啟動(dòng)子和大腸桿菌乳糖操縱元的阻遏蛋白結(jié)合位點(diǎn)嵌合而成，由IPTG誘導(dǎo)表達(dá)（Knobloch等，2011）。但是IPTG價(jià)格高且有毒性，Pspac啟動(dòng)強(qiáng)度還是不夠。Pxyl啟動(dòng)子是由木糖誘導(dǎo)表達(dá)的一類啟動(dòng)子，該系統(tǒng)調(diào)控嚴(yán)謹(jǐn)，誘導(dǎo)效率高但是卻受葡萄糖抑制。PsacB啟動(dòng)子則是利用自身的可控元件來實(shí)現(xiàn)外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)。其表達(dá)量偏低。Pglv是目前有很好的應(yīng)用潛力的啟動(dòng)子系統(tǒng)，其誘導(dǎo)物麥芽糖相對(duì)于IPTG和木糖來說價(jià)格便宜、成本低且對(duì)細(xì)菌本身無毒性，因此在工業(yè)生產(chǎn)上很有實(shí)用性價(jià)值，但是葡萄糖對(duì)其有抑制作用（楊明明和陳玉林，2013）。Yang等（2010）改善了Pglv啟動(dòng)子系統(tǒng)，大大降低了葡萄糖的抑制作用。

2 抗菌肽在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)

如上所述枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)目前還不是很完善。但是其對(duì)于飼用抗菌制劑的開發(fā)具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，加上近幾年這個(gè)系統(tǒng)的逐漸成熟，人們逐漸將抗菌肽的表達(dá)轉(zhuǎn)移到枯草芽孢桿菌上來。目前，大約有2300多種抗菌肽被發(fā)現(xiàn)，不同的抗菌肽具有不同的抑菌譜。對(duì)于枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)來講，那些對(duì)革蘭氏陰性菌有高殺傷力而對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌沒有殺傷力的抗菌肽可以采用直接表達(dá)的方法；而對(duì)于大部分既能殺滅革蘭氏陰性菌又對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有殺傷力的抗菌肽必須采用融合表達(dá)的策略。

2.1 直接表達(dá) 在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，很多致病菌是革蘭氏陰性菌，如常見的雞白痢沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌和引發(fā)仔豬白痢的大腸桿菌等。因此部分對(duì)革蘭氏陰性菌有高殺傷力而對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌沒有殺傷力的抗菌肽在畜牧業(yè)生產(chǎn)中具有重要意義。李麗等（2009）利用抗菌肽Abaecin對(duì)革蘭氏陰性菌有很強(qiáng)的殺傷力，而對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌沒有殺傷力這一特點(diǎn)選擇了枯草芽孢桿菌作為表達(dá)宿主菌。利用重疊PCR獲得了Abaecin的基因序列AP，將 AP、質(zhì)粒 pHCMC05的啟動(dòng)子 Pspac及阻遏蛋白基因LacI和質(zhì)粒pAX01的終止子t0t1插入大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒pGJ103中構(gòu)建了新型表達(dá)質(zhì)粒pGplat，并利用麥芽糖誘導(dǎo)表達(dá)抗菌肽Abaecin。在枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液中檢測(cè)到了抗菌肽Abaecin，其生物活性得到也驗(yàn)證。岳敏杰（2013）利用枯草芽孢桿菌表達(dá)質(zhì)粒pWB980為骨架構(gòu)建了大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒pWBAO，在枯草芽孢桿菌中表達(dá)了雞干擾素ChlFN-a，利用蔗糖進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，但是產(chǎn)量較低。雖然通過直接表達(dá)可以獲得一些抗菌肽，但是大部分抗菌肽具有廣譜的抗菌性，想要得到必須通過融合表達(dá)的方法獲得。

2.2 融合表達(dá) 廣譜的抗菌肽在枯草芽孢桿菌系統(tǒng)中表達(dá)面臨2個(gè)難題：抗菌肽的抗菌特性使其對(duì)宿主菌具有潛在的致命毒性；抗菌肽小分子量和高陽(yáng)離子性使其易被蛋白水解酶降解。而采用融合表達(dá)可以克服這兩個(gè)難題。Chen等（2009）利用SUMO融合技術(shù)首先在枯草芽孢桿菌中表達(dá)出了廣譜性的抗菌肽Cecropin AD，將SUMO融合蛋白和SUMO切割酶構(gòu)建到同一個(gè)質(zhì)粒載體中，從而實(shí)現(xiàn)將廣譜性抗菌肽Cecropin AD直接表達(dá)到發(fā)酵液中。陳香等 （2011）和王阿榮等（2011）將利用此種方法表達(dá)的抗菌肽直接添加到了仔豬的日糧中，結(jié)果表明這種抗菌肽制劑可顯著改善飼料轉(zhuǎn)化率，降低飼料成本，提高斷奶仔豬的生產(chǎn)性能和機(jī)體免疫性能。但是用這種方法獲得抗菌肽的產(chǎn)量偏低，不能達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的水平。 欒超（2014）比較了 3 種融合技術(shù)（Trx、Gst和SUMO）對(duì)抗菌肽CBF表達(dá)量的影響，證實(shí)SUMO融合技術(shù)效果最好。為了提高產(chǎn)量，其在枯草芽孢桿菌系統(tǒng)中分別表達(dá)SUMO融合蛋白和SUMO切割酶，但是其過程因多了一步體外切割，故較繁瑣。為了簡(jiǎn)化表達(dá)純化抗菌肽的過程，He等（2015）利用內(nèi)含肽自切割技術(shù)首次在枯草芽孢桿菌中表達(dá)出了抗菌肽CBF，并且純化過程只需一步，較為簡(jiǎn)單，但是產(chǎn)量很低，離工業(yè)化生產(chǎn)的目標(biāo)相距較遠(yuǎn)。謝海偉等（2011）和尚田田（2014）均在枯草芽孢桿菌中表達(dá)獲得抗菌肽。近年來，利用枯草芽孢桿菌表達(dá)的抗菌肽所采用的方法、融合系統(tǒng)和產(chǎn)量等指標(biāo)見表1。

表1 抗菌肽在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)

3 小結(jié)

目前，隨著枯草芽孢桿菌基因工程不斷的發(fā)展完善，越來越多的與工業(yè)發(fā)酵相關(guān)的基因獲得成功表達(dá)。但是相對(duì)于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)其還有很多需要改進(jìn)的地方，如構(gòu)建更小、拷貝數(shù)高的新型質(zhì)粒載體；進(jìn)一步提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性與安全性；遺傳操作方法需要進(jìn)一步優(yōu)化，尤其要解決枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化效率偏低的問題；篩選更強(qiáng)的啟動(dòng)子?？梢灶A(yù)見，隨著這些問題的解決，枯草芽孢桿菌將具有更為廣闊的應(yīng)用前景。

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