一株飼用產(chǎn)脂肪酶芽孢桿菌的篩選及其紫外誘變育種

郭曉軍， 郭 威， 袁洪水， 朱寶成

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071000）

脂肪酶，即甘油酯水解酶，在動物機體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用，能有效地促進(jìn)畜禽對脂肪的消化，同時還可提供一些畜禽生長過程中必需的營養(yǎng)物質(zhì)，如脂肪分解代謝產(chǎn)生的不飽和脂肪酸等（劉德海等，2012）。 Dierick 等（2004）試驗表明，部分中鏈脂肪酸能明顯抑制部分消化道有害微生物的生長，改善腸道菌落環(huán)境，從而促進(jìn)消化，起到類似抗生素的作用。脂肪酶存在于動植物和微生物中，以微生物中最多，并且微生物脂肪酶比動植物脂肪酶具有更強的酸堿耐受性和溫度適應(yīng)性 （張樹政，1984），尤其芽孢桿菌還具有較強抗逆性、易生產(chǎn)、易保存等優(yōu)點（彭立鳳，1999）。本研究擬從富含油脂的土樣中篩選具有高產(chǎn)脂肪酶活性的芽孢桿菌，并對其進(jìn)行紫外線誘變選育，以期擴大微生物脂肪酶飼料添加劑的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品 富含油脂的土樣10份，采自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)西校區(qū)附近餐廳、屠宰場。

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑 富集培養(yǎng)基（100 mL）：（NH4）2SO40.1 g，NaCl 0.05 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，K2HPO40.1g，橄欖油1mL，pH7.0，121℃滅菌 15min。

溴甲酚紫顯色培養(yǎng)基 （100 mL）：（NH4）2SO40.2 g，NaCl 0.05 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，Na2HPO40.1 g，瓊脂 1.5 g，pH 7.0，121 ℃滅菌 15 min。

三丁酸甘油脂培養(yǎng)基：用2%的聚乙烯醇溶液與三丁酸甘油酯以1∶9比例混合制成乳化液，再將乳化液與pH 8.0的Tris-HCl溶液以1∶9比例混合均勻，加入1.5%瓊脂，121℃滅菌15 min。

種子培養(yǎng)基（100 mL）：葡萄糖 2 g，蛋白胨2.5 g，橄欖油 1 mL，（NH4）2SO40.5 g，MgSO40.05 g，K2HPO40.1 g，pH 7.0，115 ℃蒸汽滅菌 30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（100 mL）：葡萄糖 0.6 g，蛋白胨2 g，橄欖油 1 mL，（NH4）2SO40.1 g，MgSO40.05 g，K2HPO40.1 g，pH 7.0，115 ℃蒸汽滅菌 30 min。

菌株生理生化鑒定試劑參見 《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)脂肪酶芽孢桿菌的初篩 取10份土樣各取1 g分別溶于10 mL無菌水中，80℃水浴30 min，然后取1 mL混懸液加入到富集培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min培養(yǎng) 2 d。

取1 mL富集培養(yǎng)液用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，然后取 10-7、10-6、10-5三個稀釋度液各 100 μL涂布于溴甲酚紫顯色培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d后觀察菌落周圍形成黃色溶解圈情況。挑選產(chǎn)生黃色溶解圈明顯的菌落于NA平板上“之”字劃線純化，挑取單菌落轉(zhuǎn)接NA斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)備用。

1.2.2 產(chǎn)脂肪酶芽孢桿菌的復(fù)篩 取少許37℃斜面活化菌，接種于50 mL種子培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min培養(yǎng)18 h，然后以9%的接種量轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃、150 r/min培養(yǎng)3 d。取1.5 mL發(fā)酵液，4℃、12000 r/min離心10 min。將已滅菌的牛津杯輕輕放置在三丁酸甘油酯平板上，然后注入100 μL上清液。37℃恒溫放置10～12 h，測量水解圈直徑并記錄。

1.2.3 脂肪酶活力測定 脂肪酶活力測定方法參見橄欖油乳化法（Macrae 和 Hammond，1985）。

1.2.4 菌株的鑒定 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定與生理生化鑒定參照 《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）。菌株16S rDNA分子生物學(xué)鑒定方法參見王偉（2014）菌種鑒定方法。

1.2.5 菌株紫外誘變 對數(shù)生長期的培養(yǎng)液，無菌水梯度稀釋至10-5，在18 W紫外燈下分別照射30、60、90、120、180、240、300 s， 照射完 4 ℃避光放置1～2 h，然后在紅光下涂布初篩培養(yǎng)基，避光培養(yǎng)1～2 d。挑選周圍有黃色溶解圈且形態(tài)不同的菌落，接種種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)16～18 h，轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃、150 r/min培養(yǎng)3 d，平板擴散法測定酶活力大小。將脂肪酶活力最高的誘變菌株連續(xù)傳代5代培養(yǎng)后測定酶活力，以檢測其遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選 本試驗采用溴甲酚紫顯色法初篩，得到56株產(chǎn)脂肪酶菌株。三丁酸甘油酯平板法復(fù)篩，優(yōu)選出11株具有較高脂肪酶活性的菌株。采用橄欖油乳化法測定酶活力，菌株3EA1-1酶活力最高，達(dá)36.1 U/mL。

2.2 菌株3EA1-1的鑒定

2.2.1 菌落和菌體形態(tài)特征 觀察菌株3EA1-1在NA培養(yǎng)基中生長24 h的菌落形態(tài)。菌落成乳白色，個體適中，形狀不規(guī)則，不透明，邊緣呈微鋸齒狀，表面干燥，無褶皺，無凸起。菌株經(jīng)結(jié)晶紫染色后顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，菌體呈桿狀散在或成串分布，革蘭氏染色呈陽性，芽孢呈橢圓形，中生。

2.2.2 16S rDNA分子生物學(xué)鑒定 經(jīng)測序，菌株3EA1-1的16S rDNA序列長1444 bp，與Gen-Bank中所有已測定的原核生物的16S rDNA序列進(jìn)行比對，選擇9株相似性較高的標(biāo)準(zhǔn)菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖1。結(jié)果顯示，供試菌株3EA1-1屬于芽孢桿菌屬，且與參比菌株Bacillus subtilis subsp.Subtilis和Bacillus tequilensis聚到了一起。

圖1 菌株3EA1-1 16s rDNA基因進(jìn)化樹

2.2.3 生理生化試驗 在分子生物學(xué)鑒定結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)行生理生化試驗，結(jié)果見表1。

表1 芽孢桿菌3EA1-1生理生化特性

結(jié)合供試菌株3EA1-1的形態(tài)特征、16S rDNA序列分析及生理生化特性，對照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，確定該菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.3 菌株3EA1-1的紫外誘變 由圖2可見，紫外誘變后挑選菌落形態(tài)差異較大的菌株進(jìn)行三丁酸甘油酯平板檢測，30 s和60 s出現(xiàn)正突變菌株較多，其中照射30 s得到的一株突變株比出發(fā)菌株脂肪酶活力提高了40%，命名為EA-30-A。經(jīng)5次傳代試驗，酶活力較傳代前降低2.27%（P＞0.05），證明該菌株的遺傳穩(wěn)定性良好，是一株比較理想的脂肪酶產(chǎn)生菌。

圖2 3EA1-1突變菌株復(fù)篩結(jié)果

3 結(jié)論

本研究采用溴甲酚紫顯色法初篩，三丁酸甘油酯平板法復(fù)篩得到11株產(chǎn)脂肪酶較高的菌株。采用橄欖油乳化法對溶解圈較大的菌株進(jìn)行酶活力測定，得到一株酶活力較高的菌株3EA1-1，酶活力達(dá)到36.1 U/mL。結(jié)合該菌株的菌落形態(tài)、菌體特征、生理生化試驗結(jié)果和16S rDNA序列分析結(jié)果，鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。并采用UV對其進(jìn)行單因子誘變，經(jīng)三丁酸甘油酯平板篩選，選育出了一株產(chǎn)脂肪酶活性高的菌株EA-30-A，其酶活力較原菌株提高了40%。同時通過傳代試驗，證明菌株的遺傳穩(wěn)定性良好。

[1]東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].科學(xué)出版社，2001.

[2]劉德海，解復(fù)紅，賈彬，等.脂肪酶及其在飼料中的作用[J].中國飼料，2012，16：31 ～ 33.

[3]彭立鳳.微生物脂肪酶的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報，1999，2：17～22.

[4]王偉，王世英，郭曉軍，等.β-葡聚糖酶產(chǎn)生菌的分離、篩選及鑒定[J].中國飼料，2014，5：17 ～ 20.

[5]張樹政.酶制劑工業(yè)（下）[M].北京：科學(xué)出版社，1984.

[6]Dierick N，Michiels J，Van Nevel C.Effect of medium chain fatty acids and benzoic acid，as alternatives for antibiotics，on growth and some gut parameters in piglets[J].Communications in agricultural and applied biological sciences，2004，69（2）：187 ～ 190.

[7]Macrae A R，Hammond R C.Present and future applications of lipases[J].Biotechnology&genetic engineering reviews，1985，3：193 ～ 217.