環(huán)磷酰胺對大鱗副泥鰍免疫抑制的研究

陳亞軍， 李 義， 徐 樂， 凌去非， 葛星星

（蘇州大學基礎(chǔ)醫(yī)學與生物科學學院，江蘇蘇州 215123）

免疫功能正常的水產(chǎn)動物對病原的入侵具有較強的抵抗力，只有當機體免疫功能低下而又遭遇病原時才會患病。因此，免疫增強劑更適用于免疫功能低下的水產(chǎn)動物。但是，目前通常是將免疫增強劑給予正常的水產(chǎn)動物后測定其免疫應答水平，依據(jù)免疫水平的提高來評定免疫增強劑的效果。實際上，對于免疫功能正常者，會因機體自身免疫系統(tǒng)存在調(diào)節(jié)作用而掩蓋免疫增強劑的真實效果（陳勇等，2005；華雪銘等，2004）。因此建立水產(chǎn)動物免疫抑制模型對水產(chǎn)動物免疫增強劑的研發(fā)具有重要的理論與實際意義。

環(huán)磷酰胺（CYP）是一種免疫抑制劑，常用于建立免疫抑制模型。目前，應用環(huán)磷酰胺已成功建立了暗紋東方鲀（華雪銘等，2004）、異育銀鯽（陳勇等，2005）、蟾胡子鲇（Kumari和 Sahoo，2005）、雜色鮑（王廣軍等，2008）、建鯉（李其繁，2009）、黃鱔（閆琳，2010）及中華絨螯蟹（王玉芬等，2014；李義等，2014）等水產(chǎn)動物的免疫抑制模型。但是，由于水產(chǎn)動物的種類較多，免疫抑制模型的通用性較差，并且，目前有關(guān)泥鰍免疫抑制模型的研究鮮見報道。因此本文報道環(huán)磷酰胺對大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus）免疫抑制的試驗結(jié)果，旨在為泥鰍免疫增強劑的研發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗魚 大鱗副泥鰍，購自蘇州奧博鰍業(yè)有限公司，外觀健康，平均體重為（16.33±0.12）g。

1.1.2 試劑與基礎(chǔ)飼料 環(huán)磷酰胺 （CYP），為Sigma公司產(chǎn)品；紅細胞數(shù) （RBC）、白細胞數(shù)（WBC）、補體 C3、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、考馬斯亮藍法蛋白定量測定試劑盒及溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus）凍干粉，均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）含量與丙二醛（MDA）含量測定試劑盒，均為蘇州科銘生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純?；A(chǔ)飼料由本實驗室自制，不含有免疫增強劑和免疫抑制劑。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 泥鰍經(jīng)過1周暫養(yǎng)后，隨機分組飼養(yǎng)于16只35cm×37.5cm×20cm的圓形塑料桶內(nèi)，每只桶放養(yǎng)18尾。養(yǎng)殖期間投喂基礎(chǔ)飼料，水溫控制在（25±0.5）℃，按常規(guī)方法進行飼養(yǎng)管理。試驗設(shè)3個CYP組（Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組）和1個對照組，每個處理組設(shè)4個重復。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別以 100、200、300 mg/kg體重的劑量腹腔注射CYP，對照組注射等量的0.85%滅菌生理鹽水。

1.2.2 樣本采集 在注射CYP后第8天自每個養(yǎng)殖桶中隨機采取3尾泥鰍，斷尾取血并采集肝胰臟，按常規(guī)方法分別制成抗凝血、血清及肝胰臟勻漿上清液備用。

1.2.3 免疫指標的測定 RBC、WBC、血清NO含量、補體C3含量、ACP與AKP活性、肝胰臟SOD活性及MDA含量的測定，參照試劑盒所述方法適當修改后進行。血清LSZ活性的測定參照Hultmark和Seiner（1980）的方法適當修改后進行。以溶壁微球菌凍干粉為底物，用0.1 mol/L pH 6.4的磷酸鹽緩沖液將底物配成一定濃度的菌懸液（OD570nm=0.3），取3 mL菌懸液與0.1 mL待測血清于試管中混勻，用分光光度計測定570nm處的初始吸光值（A0），然后置于37℃水浴30 min，取出后立即置于冰浴中（10 min）終止反應，測定吸光值（A）。 LSZ 活性（U）=（A0-A）/A。

1.3 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)用統(tǒng)計軟件SPSS18.0進行單因素方差分析，并用Duncan’s檢驗法進行均值間多重比較。P>0.05為差異不顯著，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)磷酰胺對大鱗副泥鰍外周血紅細胞數(shù)和白細胞數(shù)的影響 由表1可知，與對照組相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組的RBC和WBC分別降低45.5%、56.3%、73.5%和 78.0%、59.4%、81.0%（P ＜ 0.05）；Ⅲ組的RBC分別較Ⅰ、Ⅱ組降低51.5%和39.5%（P＜0.05），Ⅰ組和Ⅱ組之間差異不顯著 （P>0.05）；Ⅰ組和Ⅲ組的WBC分別較Ⅱ組降低45.9%和53.1%（P＜0.05），Ⅰ組和Ⅲ組之間差異不顯著（P>0.05）。上述結(jié)果表明，腹腔注射100、200、300 mg/kg體重的CYP均能顯著降低大鱗副泥鰍外周血中的紅細胞數(shù)和白細胞數(shù)，以300 mg/kg體重劑量的作用效果最佳。

2.2 環(huán)磷酰胺對大鱗副泥鰍血清一氧化氮含量的影響 由表1可知，與對照組相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組的血清NO含量分別增加216.0%、52.0%、144.0%（P＜0.05）；Ⅰ組和Ⅲ組的血清NO含量分別較Ⅱ組增加107.9%和60.5%（P＜0.05），Ⅰ組和Ⅲ組之間差異不顯著（P>0.05）。上述結(jié)果表明，腹腔注射100、200、300 mg/kg體重的CYP均能顯著提高大鱗副泥鰍血清NO含量，以100 mg/kg體重劑量的作用效果最佳。

2.3 環(huán)磷酰胺對大鱗副泥鰍血清補體C3含量的影響 由表1可知，Ⅲ組的血清補體C3含量分別較對照組、Ⅰ組和Ⅱ組降低48.6%、42.8%和35.8%（P＜0.05）；Ⅰ組、Ⅱ組和對照組3個組的血清補體C3含量無顯著差異（P>0.05）。上述結(jié)果表明，腹腔注射試驗劑量的CYP均能降低大鱗副泥鰍血清補體C3含量，300 mg/kg體重劑量的作用最顯著。

2.4 環(huán)磷酰胺對大鱗副泥鰍血清溶菌酶活性的影響 由表1可知，Ⅱ、Ⅲ組的血清LSZ活性分別較對照組和Ⅰ組降低47.8%、52.2%和40.0%、45.0%（P＜0.05）；Ⅰ組與對照組、Ⅱ組與Ⅲ組之間差異不顯著（P>0.05）。上述結(jié)果表明，腹腔注射200、300 mg/kg體重的CYP均能顯著降低大鱗副泥鰍血清LSZ活性，以300 mg/kg體重劑量的作用效果較佳。

2.5 環(huán)磷酰胺對大鱗副泥鰍血清磷酸酶活性的影響 由表1可知，與對照組相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組的血清ACP活性分別降低33.1%、41.1%和29.0%，AKP活性分別降低 55.2%、60.3%和 47.9%（P＜0.05）；3個CYP組的血清ACP和AKP活性無顯著差異（P>0.05）。上述結(jié)果表明，腹腔注射100、200、300 mg/kg體重的CYP均能顯著降低大鱗副泥鰍血清ACP和AKP活性，均以200 mg/kg體重劑量的作用效果最佳。

表1 環(huán)磷酰胺對大鱗副泥鰍9種免疫指標的影響

2.6 環(huán)磷酰胺對大鱗副泥鰍肝胰臟超氧化物歧化酶活性的影響 由表1可知，Ⅰ組和Ⅱ組的肝胰臟SOD活性與對照組和Ⅲ組相比，分別增加44.8%、91.0%和 75.1%、131.0%（P ＜0.05）；Ⅱ組的肝胰臟SOD活性比Ⅰ組增加31.9%（P＜0.05）；Ⅲ組的肝胰臟SOD活性低于對照組，但兩組之間無顯著差異（P>0.05）。由此可見，腹腔注射100、200 mg/kg體重的CYP對大鱗副泥鰍肝胰臟SOD活性均具有顯著的增強作用，以200 mg/kg體重劑量的作用效果較佳；腹腔注射300 mg/kg體重的CYP對泥鰍肝胰臟SOD活性具有一定的抑制作用。

2.7 環(huán)磷酰胺對大鱗副泥鰍肝胰臟丙二醛含量的影響 由表1可知，Ⅰ組和Ⅲ組的肝胰臟MDA含量與對照組和Ⅱ組相比，分別顯著增加47.3%、50.8%和 33.9%、37.0%（P<0.05）；Ⅱ組與對照組、Ⅰ組與Ⅲ組之間差異不顯著（P>0.05）。上述結(jié)果表明，腹腔注射100和300 mg/kg體重的CYP均能顯著提高大鱗副泥鰍肝胰臟MDA含量，以300 mg/kg體重劑量的作用效果較佳。

3 討論

紅細胞數(shù)與白細胞數(shù)是反映機體免疫狀況的常用指標。研究表明，腹腔注射一定劑量的環(huán)磷酰胺可顯著降低小鼠（Wang等，2011）和建鯉（李其繁，2009）的RBC與WBC。本試驗結(jié)果表明，對大鱗副泥鰍腹腔注射100、200、300 mg/kg體重的環(huán)磷酰胺后第8天，RBC與WBC均顯著下降。這與本研究結(jié)果相一致。

NO作為一種自由基，在動物體內(nèi)發(fā)揮著生理和病理的雙重作用。一方面可抑制和殺滅病原微生物，參與機體抗感染免疫和防御；另一方面大劑量的NO可產(chǎn)生細胞毒性作用，損傷正常組織細胞（沙愛龍等，2013）。本試驗結(jié)果顯示，對大鱗副泥鰍腹腔注射100、200、300 mg/kg體重的環(huán)磷酰胺后第8天，血清NO含量均顯著增加，表明試驗劑量的環(huán)磷酰胺可能已導致泥鰍出現(xiàn)了免疫抑制及組織損傷。推測出現(xiàn)上述結(jié)果的機制可能是泥鰍在受到環(huán)磷酰胺刺激后，誘導型NO合成酶（iNOS）mRNA的表達增加，從而導致血清NO含量明顯增加。陳炅然等（2005）發(fā)現(xiàn)，腹腔注射100 mg/kg體重的環(huán)磷酰胺可使小鼠胸腺NO水平顯著上升，這與本試驗結(jié)果一致。

補體系統(tǒng)是魚類免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其中補體C3含量的高低反應機體免疫功能的強弱。已有研究表明，環(huán)磷酰胺能顯著降低小鼠（沈赤等，2015；廖呂燕等，2010）和建鯉 （李其繁，2009）血清補體C3含量。本試驗結(jié)果顯示，腹腔注射300 mg/kg體重的環(huán)磷酰胺能顯著降低泥鰍血清補體C3含量，這與本研究結(jié)果一致。

溶菌酶是生物體內(nèi)重要的非特異性免疫因子，其通過水解細菌細胞壁的肽聚糖而發(fā)揮溶菌作用。ACP和AKP是動物體內(nèi)水解酶體系和解毒體系中的兩種重要酶類，對機體的免疫功能具有積極的影響。已有研究表明，注射環(huán)磷酰胺可顯著降低建鯉和黃鱔的血清LSZ活性（閆琳，2010；李其繁，2009）；顯著降低建鯉和中華絨螯蟹血清ACP 和 AKP 活性（王玉芬等，2014；閆琳，2010）。這與本試驗結(jié)果一致。

SOD活性的高低在一定程度反映了機體清除氧自由基的能力，MDA含量則反應了機體脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映細胞損傷的程度。已有研究表明，注射環(huán)磷酰胺能使小鼠肝組織中的SOD活性顯著降低，MDA含量顯著增加（Jnaneshwari等，2013；柯春林等，2011）。本試驗結(jié)果顯示，對大鱗副泥鰍注射試驗劑量的環(huán)磷酰胺后第8天，100、300 mg/kg組的肝胰臟MDA含量顯著高于對照組；100、200 mg/kg組的肝胰臟SOD活性顯著高于對照組，300 mg/kg組則低于對照組。這與上述研究結(jié)果基本相同。至于本試驗中泥鰍肝胰臟SOD活性的表現(xiàn)，也許可用 “毒物興奮效應”（Stebbing，1982）來解釋。

4 結(jié)論

對大鱗副泥鰍腹腔注射100、200、300 mg/kg體重的環(huán)磷酰胺，可使其免疫功能受到不同程度的抑制。從總體上看，以300 mg/kg體重劑量的作用效果最好，該劑量可用于構(gòu)建環(huán)磷酰胺誘導的大鱗副泥鰍免疫抑制模型。

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