冰片提取物對沙眼衣原體感染Hela細胞CT703及CT259表達的影響

冰片提取物對沙眼衣原體感染Hela細胞CT703及CT259表達的影響

郭翠玲趙仲平湯愛燦歐波

(海南省中醫(yī)院眼科中心，海南?？?70203)

摘要〔〕目的探討冰片提取物對沙眼衣原體感染Hela細胞CT703及CT259表達的影響。方法建立沙眼衣原體感染Hela細胞模型，將被感染后的Hela細胞放入A、B兩培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，其中A培養(yǎng)瓶培養(yǎng)基中加入冰片提取物0.3 g，而B培養(yǎng)瓶只是加入等量的培養(yǎng)基，采用RT-PCR及 Western印跡法檢測選取培養(yǎng)6、12、24 h后Hela細胞中CT703及CT259基因及蛋白表達水平。結果A培養(yǎng)瓶加入冰片提取物后，被感染的Hela細胞CT703、CT259 mRNA表達水平隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸降低(P<0.05)；B培養(yǎng)瓶中被沙眼衣原體感染的Hela細胞CT703、CT259 mRNA表達水平隨著培養(yǎng)時間的延長未出現(xiàn)明顯變化(P>0.05)。A培養(yǎng)瓶加入冰片提取物后，被感染的Hela細胞CT703、CT259蛋白表達水平隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸降低(P<0.05)；B培養(yǎng)瓶中被沙眼衣原體感染的Hela細胞CT703、CT259蛋白表達水平隨著培養(yǎng)時間的延長未出現(xiàn)明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論被沙眼衣原體感染的Hela細胞中的CT703及CT259基因及蛋白表達均處于高水平，冰片提取物能夠明顯抑制Hela細胞中CT703及CT259基因及蛋白表達，臨床能夠用于沙眼衣原體感染的治療。

關鍵詞〔〕冰片提取物；沙眼衣原體；Hela細胞；CT703；CT259

中圖分類號〔〕R285〔文獻標識碼〕A〔

第一作者：郭翠玲(1972-),女，副主任醫(yī)師，主要從事眼底疾病臨床與基礎研究。

沙眼衣原體(Ct)是一種具有細胞內二相性生活周期的嚴格細胞內寄生的微生物，內含代謝活躍、無感染性的網(wǎng)狀體和感染性強、代謝不活躍的原體。沙眼衣原體感染人后最常見是引起沙眼，還會引起包涵體結膜炎、輸卵管炎、宮頸炎以及一些性傳染性疾病，有關研究報道，人類生殖道感染沙眼衣原體后能夠增加一些傳染性疾病和生殖系統(tǒng)疾病的概率，如艾滋病、宮頸癌等〔1〕。沙眼衣原體能夠干擾宿主細胞信號傳導途徑，從而影響生物學行為，躲避宿主對其免疫，導致機體持續(xù)處于感染狀態(tài)〔2〕。在持續(xù)感染狀態(tài)下，衣原體在宿主細胞內不再繼續(xù)復制增殖，處于代謝率低下狀態(tài)，但網(wǎng)狀體將異常增大，很難被機體剔除，當宿主免疫系統(tǒng)出現(xiàn)紊亂或者低下或者其他微生物侵襲宿主時，持續(xù)感染狀態(tài)下的衣原體能夠恢復期正常的感染性，再次分化感染性強的原體。沙眼衣原體持續(xù)感染是致宿主發(fā)生疾病的一個重要方面。本文探究沙眼衣原體基因CT703、CT259在持續(xù)感染時的表達水平變化以及冰片提取物對沙眼衣原體的作用。

1資料與方法

1.1材料冰片提取物購于陜西鈺堂生物科技發(fā)展有限公司；人宮頸癌Hela細胞株購于中國醫(yī)學科學院基礎研究所；沙眼衣原體購于美國德克薩斯州健康科學中心；RPMI-1640培養(yǎng)基及Trizol試劑均購于購于美國Gibco公司；RT-PCR試劑盒、超純RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒均購于美國Promega公司；兔抗人CT703抗體、兔抗人CT259抗體、引物、Tap酶和DAB顯色劑購于Cell Signalling Technology 公司。

1.2Hela細胞培養(yǎng)無菌操作下，取人宮頸癌Hela細胞置于RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃體積分數(shù)為5%的CO2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h至生長對數(shù)期，用0.25%胰酶消化細胞，10%體積分數(shù)的小牛血清培養(yǎng)基終止消化，按照1∶3傳代培養(yǎng)，每3天傳代培養(yǎng)一次。

1.3沙眼衣原體感染模型建立預先置有玻片的24孔板內加入1 ml濃度為2×105/ml的人宮頸癌Hela細胞懸液，置于37℃體積分數(shù)為5%的CO2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)，24 h長成單層后，抽取并除去上清液，向每孔加入2 μl感染復數(shù)為1的沙眼衣原體懸液，在適宜環(huán)境中培養(yǎng)2 h后，除去上清液，并加入適量的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在沙眼衣原體感染后24、48 h后取出玻片，采用姬姆薩染色成功，于光學顯微鏡及電子顯微鏡下觀察。

1.4分組及方法向預先準備好的A、B兩個50 cm3培養(yǎng)瓶中分別加入濃度為2×105/ml的人宮頸癌Hela細胞懸液10 ml，置于37℃體積分數(shù)為5%的CO2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)，24 h長成單層后，抽取并除去上清液，除去上清液，向每個培養(yǎng)瓶中加入50 μl感染復數(shù)為1的沙眼衣原體懸液，在適宜環(huán)境中培養(yǎng)2 h后，除去上清液，并加入適量的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，向A培養(yǎng)瓶加入0.3 g冰片提取物，向B培養(yǎng)瓶加入等量RPMI-1640培養(yǎng)基，置于適宜環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)，分別取培養(yǎng)6、12、24 h后細胞備用。

1.5RT-PCR法檢測不同時間段Hela細胞CT703、CT259基因表達水平

1.5.1提取總RNA分別取A、B兩培養(yǎng)瓶不同時間段Hela細胞置于0.2%膠原酶中消化，采用D-Hanks液清洗，4℃水中30 min，1 200 r/min離心8 min，制備成單細胞沉淀，向單細胞沉淀中加入1 ml Trizol試劑，采用超純RNA提取試劑盒提取Hela細胞中總RNA。實驗操作按產(chǎn)品說明書進行，用紫外分光光度法測定RNA的OD260/OD280確定總RNA純度。

1.5.2RT-PCR根據(jù)逆轉錄試劑盒要求進行反轉錄反應操作，按照相關文獻資料設計PCR中內參照CT110、CT703和CT259引物，將RNA模板、引物、5倍緩沖液和RNase-free水溶解并置于冰上備用，將2 μl引物混合物試劑和10 μl消化后RNA分別加入20 μl反應體系的第一部分，混勻。PCR反應體系經(jīng)過PCR反應條件的優(yōu)化，PCR循環(huán)條件為94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，共35個循環(huán)，最后72℃再延伸5 min。引物序列：CT259-正義鏈5′-TGGAATTCGGATTGTTGCGGATTTCG-3′,反義鏈5′-CTCGAGCGTTAACGCATCCGAACCAG-3′，產(chǎn)物747 bp；CT703-正義鏈5′-ACTCGTAAGGTTTCGTCA-3′,反義鏈5′-CTCGTAAATAAATGGGACTT-3′,產(chǎn)物352 bp;CT110-正義鏈5′-CTAATGAGTTGACCGCCAGT-3′,反義鏈5′-GACGCTTTGGTTCTAATCTACGA-3′,產(chǎn)物323 bp。

1.5.3結果分析PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，溴乙啶染色，通過成像分析scion軟件計算和比較CT703和CT259產(chǎn)物條帶的吸光度值，并與CT110條帶光密度值比較，計算出CT703和CT259在Hela細胞中mRNA表達含量相對值。

1.6Western印跡法檢測不同時間段Hela細胞CT703、CT259蛋白表達無菌操作下，分別取A、B兩培養(yǎng)瓶不同時間段Hela細胞，將選取好的Hela細胞經(jīng)PBS緩沖液洗滌，洗滌后離心收集，用冰冷PBS洗滌細胞3次后，加入裂解緩沖液，搖勻，置于4℃水中冰浴30 min，1 200 r/min離心10 min，吸取上清液，即胞質蛋白。采用BCA法對樣品蛋白質進行蛋白定量。調整樣品蛋白量為30～40 μg后進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，并將蛋白質轉移到PVDF膜上。PBST洗膜5 min后，PBST溶解封閉PVDF膜2 h。繼而加入兔抗人CT703抗體、兔抗人 CT259抗體(按1∶1 000稀釋)或抗β-actin(1∶2 000稀釋)，置于4℃環(huán)境中過夜。PBST洗滌3次，每次10 min，加入二抗，溫室孵育2 h。再次用PBST洗滌3次，每次10 min。將PVDF膜ECL顯色，在暗室中將PBVF曝光于X光片中，用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結果。

1.7統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0進行t檢驗。

2結果

2.1總RNA提取結果紫外分光光度法測定中可知Hela細胞CT703、CT259 RNA OD260/OD280值在1.8～2.0之間，在1.2%的瓊脂糖凝膠電泳可觀察到28S、18S、5S三條產(chǎn)物條帶，說明提取Hela細胞中的總RNA完整性較好。如圖1。

2.2不同時間段Hela細胞CT703、CT259 mRNA表達比較A培養(yǎng)瓶加入冰片提取物后，被感染的Hela細胞CT703、CT259 mRNA表達水平隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸降低，且培養(yǎng)24 h后Hela細胞CT703、CT259 mRNA表達水平明顯低于培養(yǎng)6 h(P<0.05)；而B培養(yǎng)瓶中被感染的Hela細胞CT703、CT259 mRNA表達水平隨著培養(yǎng)時間的延長未出現(xiàn)明顯變化(P>0.05)；A培養(yǎng)瓶培養(yǎng)24 h后Hela細胞CT703、CT259 mRNA表

達水平明顯低于B培養(yǎng)瓶(P<0.01)。見表1，圖2。

2.3不同時間段Hela細胞CT703、CT259蛋白表達比較A培養(yǎng)瓶加入冰片提取物后，被感染的Hela細胞CT703、CT259蛋白表達水平隨培養(yǎng)時間延長而逐漸降低，且培養(yǎng)24 h后Hela細胞CT703、CT259蛋白表達水平明顯低于培養(yǎng)6 h(P<0.05)；而B培養(yǎng)瓶中被感染的Hela細胞CT703、CT259蛋白表達水平隨著培養(yǎng)時間的延長未出現(xiàn)明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；A培養(yǎng)瓶培養(yǎng)24 h后Hela細胞CT703、CT259蛋白表達水平明顯低于B培養(yǎng)瓶(P<0.01)。見表2，圖3。

圖1　RNA樣品凝膠電泳結果

圖2　沙眼衣原體感染Hela細胞不同時間點CT259、CT703、 CT110 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

組別CT7036h12h24hCT2596h12h24hA培養(yǎng)瓶0.64±0.110.51±0.130.34±0.061)2)0.71±0.120.43±0.120.31±0.041)2)B培養(yǎng)瓶0.66±0.050.71±0.120.69±0.110.72±0.130.77±0.110.78±0.12

與培養(yǎng)6 h比較：1)P<0.05；與B培養(yǎng)瓶比較：2)P<0.01，下表同

表2　不同時間段Hela細胞CT703、CT259蛋白表達比較

圖3　沙眼衣原體感染Hela細胞不同時間點CT259、CT703、 CT110蛋白表達

3討論

沙眼衣原體寄生宿主細胞后期代謝活躍，無感染性的網(wǎng)狀體在細胞內逐漸增大，當宿主免疫功能出現(xiàn)低下或其他微生物侵襲宿主時，衣原體會趁機恢復其二相性生活周期，分化成具有強傳染性的原體，從而導致宿主發(fā)生病變〔3〕。研究表明，沙眼衣原體持續(xù)感染狀態(tài)下基因轉錄發(fā)生很大的變化，與信號傳導有關的基因會隨著沙眼衣原體寄生宿主的狀態(tài)而發(fā)生改變，轉變或上調或下調〔4〕。

本研究結果顯示，當感染一定時間后，隨著時間后的延長Hela細胞中CT259、CT703基因及蛋白表達量為出現(xiàn)明顯變化，說明持續(xù)感染狀態(tài)下，沙眼衣原體在宿主細胞內處于休眠狀態(tài)，維持無感染性的網(wǎng)狀體生活相，以保護沙眼衣原體的活性。當宿主機體處于低水平的免疫狀態(tài)或者其他微生物侵襲時，沙眼衣原體將恢復其感染狀態(tài)，分化具有強感染性的原體，破壞宿主細胞、組織從而導致疾病發(fā)生〔5～7〕。本研究說明冰片提取物能夠協(xié)助宿主免疫系統(tǒng)清除因持續(xù)感染而逐漸增多的沙眼衣原體網(wǎng)狀體，從而有效阻止沙眼衣原體所導致宿主細胞、組織損傷發(fā)生疾病。冰片提取物主要成分為龍腦、異龍腦、右旋龍腦等化合物〔8〕。龍腦、異龍腦均具有耐缺氧作用，具有較好的鎮(zhèn)靜、止痛功效，較高濃度的龍腦及異龍腦對葡萄球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌、大腸桿菌以及皮膚真菌等均有較強的抑制作用〔9～11〕。冰片提取物其化學成分能夠激活宿主的巨噬細胞、自然殺傷細胞活性，提高單核細胞的循環(huán)和免疫細胞表面抗原和抗體的表達，增強宿主免疫系統(tǒng)對沙眼衣原體網(wǎng)狀體的識別和清除，有效阻止了網(wǎng)狀體轉化為具有感染性、致病性的原體〔12〕。

綜上所述，沙眼衣原體寄生宿主細胞后干擾細胞信號傳導，躲避宿主免疫系統(tǒng)的清除，進而轉化為無感染性的網(wǎng)狀體，

使沙眼衣原體感染后Hela細胞中CT259、CT703基因及蛋白表達處于高水平狀態(tài)。冰片提取物通過增強對網(wǎng)狀體的識別和宿主免疫系統(tǒng)，有效的清除長期寄生于細胞內的沙眼衣原體。冰片提取物能夠清除機體內寄生的沙眼衣原體，有利于提高沙眼衣原體感染所致疾病的治療，對臨床具有重要的指導意義。

4參考文獻

1Rita Ferreira，Vitor Borges，Alexandra Nunes,etal.Assessment of the load and transcriptional dynamics of Chlamydia trachomatis plasmid according to strains' tissue tropism〔J〕.Microbiol Res，2013；168(6)：333-9.

2Althaus CL，Turner KME，Schmid BV,etal.Transmission of Chlamydia trachomatis through sexual partnerships：a comparison between three individual-based models and empirical data〔J〕.J Royal Soc Interf，2012；9(66)：136-46.

3Won BY，Lee DW，Shin SC,etal.A DNA intercalation-based electrochemical method for detection of Chlamydia trachomatis utilizing peroxidase-catalyzed signal amplification〔J〕.Biosensors Bioelectronics，2008；24(4)：665-9.

4Kawana K，Quayle AJ，F(xiàn)icarra M,etal.CD1d degradation in Chlamydia trachomatis-infected epithelial cells is the result of both cellular and chlamydial proteasomal activity〔J〕.J Biol Chem，2007；282(10)：7368-75.

5Voevodskaya N，Galander M，Hogbom M,etal.Structure of the high-valent FeⅢFeⅣ state in ribonucleotide reductase (RNR) of Chlamydia trachomatis--combined EPR，57Fe-，1H-ENDOR and X-ray studies〔J〕.Biochim Biophy Acta Biomem，2007；1774(10)：1254-63.

6Zheng Y，Zhao WM，Wang H,etal.Codon usage bias in Chlamydia trachomatis and the effect of codon modification in the MOMP gene on immune responses to vaccination〔J〕.Biochem Cell Biol，2007；85(2)：218-26.

7陸洋，杜守穎，姚宗玲，等.天然冰片、合成冰片對梔子提取物黏膜促滲作用研究〔J〕.中國中藥雜志，2009；34(10)：1207-10.

8Vardhan H，Bhengraj AR，Jha R，etal.Higher expression of ferritin protects Chlamydia trachomatis infected HeLa 229 cells from reactive oxygen species mediated cell death〔J〕.Biochem Cell Biol，2010；88(5)：835-42.

9Dessus-Babus S，Moore CG，Whittimore JD,etal.Comparison of Chlamydia trachomatis serovar L2 growth in polarized genital epithelial cells grown in three-dimensional culture with non-polarized cells〔J〕.Microb Infect，2008；10(5)：563-70.

10Sun HS，Wilde A，Harrison RE,etal.Chlamydia trachomatis inclusions induce asymmetric cleavage furrow formation and ingression failure in host cells〔J〕.Mol Cell Biol，2011；31(24)：5011-22.

11蔡冬梅，陳雪梅，殷勝利，等.通心絡膠囊治療原發(fā)性高血壓病人眼底病變的療效觀察〔J〕.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2002；8(9)：51-2.

12伍海濤，唐由之，王寧生，等.含冰片眼用制劑的文獻調查〔J〕.中國中醫(yī)眼科雜志，2012；22(2)：141-4.

〔2013-12-13修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)