鋅對缺血后適應(yīng)預(yù)防糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響

鋅對缺血后適應(yīng)預(yù)防糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響

路航余欣趙昕

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院心血管病診療中心,吉林長春130021)

摘要〔〕目的探討鋅對離體糖尿病(DM)大鼠缺血后適應(yīng)預(yù)防心肌缺血再灌注損傷作用的影響。方法高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)建成2型DM(T2DM)大鼠模型，將40只雄性Wistar大鼠隨機(jī)平均分為正常大鼠缺血再灌注組(A 組:N+I/R)，正常大鼠缺血后適應(yīng)組(B組)，DM大鼠后適應(yīng)組(C組)，鋅干預(yù)DM大鼠后適應(yīng)組(D組)。四組均采用離體大鼠心臟灌流模型方法，全心停灌30 min，復(fù)灌60 min，制成心肌缺血再灌注模型，對B、C、D三組在再灌注初始時(shí)，均先給予再灌注10 s，全心停灌10 s，共6次循環(huán)的缺血后適應(yīng)干預(yù)。測定左室收縮壓(LVSP)和再灌30 min冠狀動(dòng)脈流出液中乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的含量。分離左室心肌并測定心肌梗死面積，對心肌進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色測定磷酸化蛋白激酶B(P-Akt)和磷酸化糖原合成酶激酶(GSK-3β)的表達(dá)。結(jié)果D組與C組相比，鋅干預(yù)的離體DM大鼠心臟缺血后適應(yīng)可顯著改善再灌注后LVSP以及左心室內(nèi)壓最大上升速率(+dP/dtmax)等血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，并顯著減少了再灌注后LDH與CK的釋放量；同時(shí)缺血后適應(yīng)干預(yù)減少了心肌梗死的面積,P-Akt及P-GSK-3β的表達(dá)增加。C組與A組相比，對DM大鼠給予缺血后適應(yīng)處理后，其血流動(dòng)力學(xué)無明顯改善，且心肌酶釋放量未減低，同時(shí)也沒有顯著減少心梗面積，P-Akt,P-GSK-3β的表達(dá)減少。結(jié)論鋅干預(yù)的離體大鼠心臟恢復(fù)或增強(qiáng)了缺血后適應(yīng)對DM大鼠心肌再灌注損傷的保護(hù)作用，其機(jī)制與鋅使DM大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)P-Akt及P-GSK-3β增強(qiáng)，進(jìn)而使缺血后心肌梗死面積減小和心肌酶釋放量減少有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕鋅；糖尿?。蝗毖筮m應(yīng)；再灌注損傷；P-Akt；GSK-3β

中圖分類號(hào)〔〕R541〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

通訊作者：趙昕(1964-)，男，教授，主要從事糖尿病心肌病與缺血再灌注損傷的研究。

第一作者：路航(1987-)，男，在讀碩士，主要從事糖尿病心肌病與缺血再灌注損傷的研究。

糖尿病(DM)為冠心病的高危因素，DM人群中心肌梗死的發(fā)生率是非DM人群的2～6倍，其再灌注治療后發(fā)生心肌再灌注損傷的比例也明顯增高〔1〕，2/3左右的DM患者死因?yàn)樾难芗膊　?〕。目前急性心肌梗死治療原則是通過溶栓或冠脈介入(PCI)開通病變血管來挽救心肌細(xì)胞，但再灌注治療引起的再灌注損傷值得關(guān)注，Zhao等〔3〕首次將缺血再灌注心肌的保護(hù)作用命名為缺血后適應(yīng)。同時(shí)已有很多研究證實(shí)DM使缺血后適應(yīng)預(yù)防心肌缺血發(fā)生再灌注損傷的作用減弱或消失，但用何種方法能干預(yù)激活再灌注損傷救援信號(hào)傳導(dǎo)途徑具有更大的臨床指導(dǎo)意義。本研究旨在探討鋅對DM大鼠心肌的缺血后保護(hù)作用的影響和機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒購于南京建成生物研究所，蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(P-Akt)、糖原合成酶激酶(GSK)-3β、磷酸化GSK(P-GSK)-3β抗體購于美國Cell Signaling 公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組40只清潔級(jí)雄性Wistar大鼠，體重180～250 g，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部公衛(wèi)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將大鼠隨機(jī)分為正常大鼠缺血再灌注組(A 組)，正常大鼠缺血后適應(yīng)組(B 組)，DM大鼠后適應(yīng)組(C 組)，ZnSO4干預(yù)DM大鼠后適應(yīng)組(D組)，每組10只。

1.3DM大鼠模型建立方法給予成年雄性Wistar 大鼠高脂飼料喂養(yǎng)28 d建立胰島素抵抗模型，然后給予大鼠2%鏈脲佐菌素(STZ)(40 mg/kg) 一次性腹腔注射，給藥7 d后，檢測血糖>16.7 mmol/L為DM大鼠模型成功，大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)4 w。

1.4大鼠心臟離體灌注給予大鼠10%水合氯醛腹腔注射,然后腹腔注射肝素500 U抗凝，取出大鼠心臟，將離體大鼠心臟浸于4℃Krebs-Henseleit緩沖液(成分：118 mmol/L氯化鈉，25 mmol/L碳酸氫鈉，1.2 mmol/L磷酸二氫鉀，4.7 mmol/L氯化鉀，3.0 mmol/L氯化鈣，1.2 mmol/L硫酸鎂，11 mmol/L葡萄糖，0.5 mmol/L乙二胺四乙酸，pH7.4)中，1 min內(nèi)主動(dòng)脈插管懸掛于Langendorff裝置上，用改良Krebs-Henseleit緩沖液行非循環(huán)式主動(dòng)脈逆行灌流，灌流壓65 mmHg,灌流液溫度維持在37℃，pH7.4,灌流液以95%氧氣，5%二氧化碳混合氣飽和。A組經(jīng)歷全心停灌缺血30 min，60 min 復(fù)灌再灌注期；B、C、D三組全心停灌缺血30 min后，再灌注開始前先給予再灌注10 s，全心停灌缺血10 s，共6次循環(huán)的缺血后適應(yīng)處理，然后繼續(xù)給予再灌注至60 min。

1.5血流動(dòng)力學(xué)測心功能將1個(gè)連接于壓力換能器的球囊插入左心室,連接囊的導(dǎo)管內(nèi)充滿生理鹽水(事先應(yīng)排盡空氣)，壓力換能器的另一端接于八道生理記錄儀RM-6000，由其來記錄左心室內(nèi)壓力的變化，分別于缺血前平衡期，再灌期30 min記錄左心室收縮壓(LVSP)、心率(HR)、左心室內(nèi)壓最大上升速率(+dP/dtmax)。

1.6冠脈流出液LDH和CK含量測定收集平衡灌流20 min、再灌注30 min的冠脈循環(huán)流出液，半自動(dòng)分光光度儀測定LDH及CK含量。

1.7心梗面積測定再灌注60 min后迅速取下離體大鼠心臟，分離左心室心肌并將其橫切成五片，置入氯化三苯基四氮唑(TTC)中，37℃水浴15 min，置入10%中性甲醛固定過夜，然后分離壞死區(qū)和非壞死區(qū)后稱重(非壞死區(qū)染成磚紅色，壞死區(qū)呈灰白色)，梗死范圍以壞死心肌質(zhì)量占左心室心肌質(zhì)量的百分比表示。數(shù)碼照相后用IMAGE TOOL電腦軟件分析梗死范圍。

1.8免疫組化染色石蠟包埋組織切片，常規(guī)脫蠟至水，以3% H2O2室溫孵育5～10 min，蒸餾水洗3次；枸櫞酸鹽緩沖液中微波修復(fù)抗原，冷卻后，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗1～2次；5%～10%正常山羊血清封閉非特異性抗原，室溫孵育20 min，甩去多余液體，不洗；分別滴加適當(dāng)稀釋的特異性一抗，4℃過夜；根據(jù)一抗的不同，滴加相應(yīng)二抗(IgG/Biotin)，室溫孵育40 min，PBS洗3次，5 min/次；滴加相應(yīng)辣根過氧化物酶(S-A/HRP)工作液，室溫孵育20 min，PBS洗4次，5 min/次；二氨基聯(lián)苯胺雙氧水(DAB-H2O2)顯色，室溫5～30 min，蒸餾水洗滌；蘇木素復(fù)染，中性樹脂封片；顯微鏡下拍攝切片圖形。

2結(jié)果

2.12型糖尿病(T2DM)大鼠模型指標(biāo)正常大鼠進(jìn)食，飲水量正常,情緒穩(wěn)定,毛色白而有光澤。高脂飲食組給予2%STZ腹腔內(nèi)注射后 ，飲水量較造模前明顯增加,精神萎靡,毛色發(fā)黃，無光澤，尿量增加明顯，給予2%STZ腹腔內(nèi)注射第7天，DM組血糖明顯高于正常組，體重下降高于正常組(P<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠血糖以及體重比較( ± s， n=20)

2.2血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較B組再灌注30 min HR、LVSP、+dP/dtmax恢復(fù)明顯高于A組(P<0.05)。 C組與A組無顯著差別(P>0.05)，D組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比A組及C組明顯改善(P<0.05)。見圖1。

2.3冠狀動(dòng)脈流出液LDH、CK含量再灌注30 min，與平衡期相比，正常大鼠各組冠脈流液中LDH、CK含量升高顯著，B組再灌注30 min脈流液中LDH、CK含量明顯低于A組(P<0.05)。C組再灌注30 min脈流液中LDH、CK含量與A組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，D組LDH、CK含量明顯降低(P<0.05)。見圖2。

2.4心肌梗死范圍B組心梗面積比A組面積減少(29.50%±3.4% vs 45.65%±4.8%，P<0.01)。C組心梗面積(50.12%±3.7%)與A組心梗面積無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，D組心梗面積(31.10%±3.4%)比C組顯著減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

與A組比較：1)P<0.05；與C組比較：2)P<0.05，下圖同 圖1　各組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)

圖2　再灌注前后各組心肌酶釋放

2.5免疫組化染色B組P-Akt、P-GSK-3β表達(dá)明顯強(qiáng)于A組；C組表達(dá)均明顯弱于B組，而與A組比較無明顯差別，D組較C組明顯增強(qiáng)。見圖3。

A 組 P-Akt

A組 P-GSK-3β

B組 P-Akt

B組 P-GSK-3β

C組 P-Akt

C組 P-GSK-3β

D組 P-Akt

D組 P-GSK-3β

3討論

目前，缺血預(yù)適應(yīng)處理對DM缺血心肌發(fā)生再灌注損傷的保護(hù)作用減弱的機(jī)制研究尚不清楚，后適應(yīng)與預(yù)適應(yīng)的心肌保護(hù)作用機(jī)制相近，均與再灌注損傷救援激酶(RISK)信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)〔4〕。已有一些實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)預(yù)適應(yīng)對于DM心肌無保護(hù)作用〔5〕。本實(shí)驗(yàn)說明DM心肌的代謝狀態(tài)，使Akt磷酸化水平降低，導(dǎo)致GSK-3β 的磷酸化水平發(fā)生降低，進(jìn)而使得心肌缺血后適應(yīng)保護(hù)機(jī)制發(fā)生作用的RISK信號(hào)傳導(dǎo)通路受損，DM缺血后適應(yīng)保護(hù)作用減弱。

鋅是生物體內(nèi)必需的金屬元素，發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)，其中在抗細(xì)胞凋亡過程中起到重要作用〔6〕。鋅在直接作用于PI3K-Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路級(jí)聯(lián)反應(yīng)的初始階段，通過下調(diào)蛋白酪氨酸磷酸化酶(PTPase)的活性，使對Akt2激活的抑制作用減弱，Akt磷酸化增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致GSK-3β 的磷酸化水平發(fā)生降低，心肌細(xì)胞的保護(hù)作用得以實(shí)現(xiàn)〔7〕。從實(shí)驗(yàn)中注意到：鋅作為GSK-3β 抑制劑在DM心肌缺血再灌注損傷過程中具有明確的心肌保護(hù)作用，但是其確切機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。

4參考文獻(xiàn)

1Juutilainen A,Lehto S,Ronnemaa T,etal.Type 2 diabetes as a "coronary heart disease equivalent":an 18-year prospective population based study in Finnish subjects〔J〕.Diabetes Care,2005;28(12):2901.

2Ali Raza J,Movahed A.Current concepts of cardiovascular diseases in diabetes mellitus〔J〕.Int J Cardiol,2003;89(2-3):123-34.

3Zhao ZQ,Corvera JS,Halkos ME,etal.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparison with ischemic preconditioning〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003;285(2):H579-88.

4Hausenloy DJ,Yellon DM.Survival kinases in ischaemic preconditioning and postconditioning〔J〕.Cardiovasc Res,2006;70(2):240-53.

5Nieszner E,Posa I,Kocsis E,etal.Influence of diabetic state and that of different sulfonylureas on the size of myocardial infarction with and without ischemic preconditioning in rabbits〔J〕.Exp Clin End Diabetes,2002;110(5):212-8.

6Chimienti F,Aouffen M,Favier A,etal.Zinc homeostasis-regulating proteins:new drug targets for triggering cell fate〔J〕.Curr Drug Targets,2003;4(4):323-38.

7Chanoit G,Lee S,Xi J,etal.Exogenous Zinc protects cardiac cells from reperfusion injury by targeting mitochondrial permeability transition pore through inactivation of glycogen synthase kinase-3beta〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2008;295(3):H1227-33.

〔2014-06-11修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)