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    翹嘴鱖miR-146a在胚胎發(fā)育過程中的表達及溫度對其表達的影響

    2015-12-24 01:37:39汪建華張建社褚武英
    湖南師范大學自然科學學報 2015年5期
    關鍵詞:水溫胚胎時期

    朱 鑫,易 潭,陳 琳,吳 萍,汪建華,陳 韜,張建社,褚武英

    (1. 長沙學院生物與環(huán)境工程系,中國 長沙 410003;2.湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,中國 長沙 410128)

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    翹嘴鱖miR-146a在胚胎發(fā)育過程中的表達及溫度對其表達的影響

    朱鑫1, 2#,易潭1,2#,陳琳1,吳萍1,汪建華1,陳韜2,張建社1,褚武英1

    (1. 長沙學院生物與環(huán)境工程系,中國 長沙410003;2.湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,中國 長沙410128)

    摘要為了解翹嘴鱖胚胎發(fā)育中miR-146a的表達規(guī)律以及溫度對miR-146a表達的影響,將翹嘴鱖受精卵分別在22 ℃和25 ℃水溫下孵化,并利用實時熒光定量方法檢測miR-146a在各個發(fā)育階段的表達.結果顯示,在22 ℃孵化時,miR-146a的表達在原腸期前處于較高水平且各時期表達沒有顯著性差異(P>0.05),在尾芽期后出現(xiàn)顯著性降低(P<0.05),并在出膜時達到最低值;在25 ℃孵化時,miR-146a的表達直到神經(jīng)胚期仍處于較高水平且各時期表達沒有顯著性差異(P>0.05),發(fā)育進入尾芽期后表達顯著降低(P<0.05),在肌效期達到最低值;miR-146a在25 ℃水溫孵化時的表達較22 ℃孵化同時期的表達都出現(xiàn)顯著降低(P<0.05).研究表明,miR-146a可能主要在胚胎發(fā)育后期起到調控胚胎發(fā)育的作用,在尾芽期后通過下調表達來促進胚胎的發(fā)育;并且溫度能影響miR-146a的表達,溫度升高會降低miR-146a在胚胎發(fā)育各個時期的表達,將有利于胚胎的發(fā)育.

    關鍵詞翹嘴鱖;miR-146a;發(fā)育性表達;胚胎發(fā)育;溫度調節(jié)

    ExpressionAnalysisofSiniperca ChuatsiMiR-146aDuringEmbryonic

    上世紀80年代,隨著鱖魚人工繁殖獲得成功,我國開始大規(guī)模推廣鱖魚養(yǎng)殖,使之成為我國主要名貴養(yǎng)殖魚類之一.翹嘴鱖因其肉質細嫩而鮮美,無小刺,且富含蛋白質,現(xiàn)已成為水產(chǎn)品市場的緊俏商品和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要品種[1].深入探索翹嘴鱖的發(fā)育機制能夠為魚類發(fā)育生物學研究和水產(chǎn)養(yǎng)殖提供一些有價值的參考資料.

    microRNA(miRNA) 是真核生物中一類進化上保守的參與調控基因表達的非編碼小分子RNA.它通過與靶基因3′端非翻譯區(qū)互補配對來促進靶mRNA降解或翻譯抑制,在基因表達中起著負調控作用[2-3].miRNA在胚胎發(fā)育、細胞增殖與分化、腫瘤發(fā)生和新成代謝等一系列生物過程中發(fā)揮重要的作用[4-5],但是有關miRNA在胚胎的表達特性及其在魚類早期發(fā)育中的功能研究還很少.早期的研究表明miRNA對胚胎發(fā)育起到重要作用.鼠和人的胚胎干細胞在發(fā)育形成胚胎小體時,胚胎干細胞中一些特定的miRNA的表達會下調[6-7],缺失miRNA的鼠和斑馬魚胚胎在原腸胚形成、神經(jīng)發(fā)育、體節(jié)形成時出現(xiàn)發(fā)育畸形甚至停滯[8-9].Kuang等[10]發(fā)現(xiàn)miR-146a能夠與Numb基因的3′端非翻譯區(qū)互補配對,并且驗證了miR-146a能夠抑制Numb的表達,而Numb調控的靶基因Notch參與一系列胚胎發(fā)育和形態(tài)形成過程,如成肌細胞的增殖、神經(jīng)發(fā)育和體節(jié)形成[11],因此可以推斷miR-146a很可能參與調控胚胎的發(fā)育.

    水溫可以改變胚胎發(fā)育所需時間,較高的孵化溫度能加速魚類胚胎的發(fā)育速率,縮短孵化所需的時間[12].何利君[13]的研究顯示,翹嘴鱖胚胎發(fā)育在21,25和27 ℃下,分別經(jīng)過74.05,56.73和48.37h孵育后出膜.在適宜溫度范圍內,適當升溫可以加快胚胎發(fā)育的進程,但miRNA是否參與到水溫影響翹嘴鱖胚胎發(fā)育的分子機制中尚不明確.在本研究中,我們分別在22和25℃水溫下孵化翹嘴鱖的受精卵,并利用實時熒光定量的方法檢測miR-146a在幾個重要發(fā)育階段的表達,以此了解miR-146a在胚胎發(fā)育進程中的表達模式及水溫對miR-146a表達的影響.

    1材料與方法

    1.1實驗魚

    實驗用親魚為湖南省水產(chǎn)科學研究所無病無傷、體格健壯、性腺成熟度好的翹嘴鱖,雌性個體為體質量1.0kg以上的2~4齡魚,雄性個體為體質量0.75kg以上的2~4齡魚.

    1.2方法

    1.2.1不同溫度下胚胎的孵化和取樣使用寧波市激素制品有限公司生產(chǎn)的絨毛膜促性腺激素(HCG)、促黃體生成素釋放激素類似物和鯉鯽魚腦垂體(PG)對親魚進行人工催產(chǎn),操作方法參考劉希良[14]等文獻報導.將受精卵置于直徑15cm的玻璃培養(yǎng)皿中,每個培養(yǎng)皿放200~300顆,分別在22 ℃和25 ℃的水溫中孵化.期間,每半小時更換一次曝氣水以保證溶氧充足.自受精后定時將翹嘴鱖魚卵置于顯微鏡下觀察翹嘴鱖胚胎的發(fā)育進程,當所有魚卵半數(shù)以上達到某個時期時確定為到達該時期.當受精卵進入二細胞、囊胚、原腸、神經(jīng)、尾芽、肌效、心搏、出膜期時,分別取適量受精卵置于裝有Trizol的2mL離心管中,每個時期取5管平行樣,置于-20 ℃冰箱保存.

    1.2.2總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成保存于Trizol中的受精卵用破口槍頭吸打數(shù)次,直至胚胎全部破碎,然后置于裝有1mLTrizol的離心管中.總RNA提取流程參照TrizolReagent(Invitrogen)說明書操作.所有總RNA樣品分別取1μL作為模板,按照OneStepPrimeScriptmiRNAcDNAsynthesisKit試劑盒(寶生物公司,大連)的說明進行逆轉錄,合成的cDNA第一鏈,于4 ℃冰箱保存待用.

    1.2.3實時熒光定量檢測miR-146a的表達根據(jù)Chu等[15]建立的鱖魚miRNA文庫,設計miR-146a特異性的上游引物,以管家基因β-actin作為胚胎發(fā)育階段樣品的內參基因[16].用Primer5.0軟件設計熒光定量PCR的引物,引物由上海鉑尚生物公司合成 (見表1).取2μL逆轉錄好的cDNA為模板,加入12.5μLSYBRPremixExTaqⅡ (寶生物公司, 大連),1μL特異性的上游引物和1μL通用下游引物(Uni-miRqPCRPrimer, 10μmol/L, 寶生物公司), 8.5μL的無菌水,總體積25μL,擴增反應在Bio-RadCFX96system(USA)上進行.擴增條件為:(1)95 ℃預變性60s;(2)擴增和定量,95 ℃變性5s,60 ℃退火和延伸25s,重復40個循環(huán).(3) 繪制融解曲線(65~95 ℃,每0.1 ℃檢測一次熒光值).

    表1 熒光定量檢測用引物

    注:miR-146a定量所使用的下游引物為通用引物,序列未公布,購自寶生物工程(大連)有限公司(濃度:10μmol/L).

    1.2.4數(shù)據(jù)處理相對表達結果計算公式為R=2-ΔΔCt,其中Ct值為PCR反應循環(huán)閾值,ΔΔCt的計算公式為:ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內參基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct內參基因)對照組.采用SPSS12.0軟件對所得相對表達豐度數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-wayANOVA),并采用最小顯著差數(shù)法(LSD)進行多重比較(P<0.05表示顯著性差異,P<0.01表示差異極顯著),結果以平均值±標準誤差(Mean±SE,n=5)表示.

    2結果與分析

    2.1miR-146a在胚胎發(fā)育性表達

    有文獻報道m(xù)iRNA在不同的細胞和不同的發(fā)育階段有差異性的表達,并且它們參與細胞的生長、分化以及凋亡等過程[17-18].目前miRNA在魚類胚胎發(fā)育階段的表達研究還較少,且暫未有文獻報道m(xù)iR-146a在魚類胚胎的發(fā)育性表達.圖1結果顯示,胚胎在22 ℃水溫孵化下,miR-146a的表達在發(fā)育早期處于較高水平,其中原腸期前的各時期表達沒有顯著性差異,進入尾芽期后顯著性地降低,并持續(xù)降低,在出膜期時達到最低水平.而在25 ℃孵化時,miR-146a的表達在神經(jīng)期前處于較高水平且各時期都沒有顯著性差異,在尾芽期顯著性地降低,在肌效期達到最低值,心搏期和出膜期處于較低水平并且之間沒有顯著性差異(圖1).

    圖1 miR-146a在翹嘴鱖受精卵不同發(fā)育時期的相對表達情況.A和B分別為miR-146a在22 ℃和25 ℃水溫孵化下不同時期的發(fā)育性表達.相對表達值為平均值±標準誤差(n=5).不同的字母代表存在顯著性差異(P<0.05)Fig.1 Detection of miR-146a expression at different embryonic developmental stages. A, B represent miR-146a expressed at different embryonic developmental stages when incubation under 22 ℃and 25 ℃ water temperature, respectively. Values are the mean ±SE, n=5. The different letters indicate significant differences between columns (P<0.05)

    2.2miR-146a在不同溫度孵化下的差異性表達

    圖1的結果顯示溫度影響了miRNA在胚胎發(fā)育中的表達.當比較胚胎發(fā)育同一時期在22 ℃和25 ℃水溫孵化下miR-146a的表達時發(fā)現(xiàn),miR-146a在25 ℃水溫孵化時的表達較22 ℃孵化下同時期的表達都出現(xiàn)顯著性地降低,其中除出膜期外,其他時期的表達差異極顯著(P<0.01)(圖2).

    圖2 miR-146a在翹嘴鱖受精卵不同水溫孵化下,同一時期的差異性表達.每個時期均以22 ℃孵化下的表達值作為對照,*代表顯著性差異(P<0.05),**代表差異極顯著(P<0.01)Fig.2 The contrastive expression of miR-146a incubated under different water temperature. The data was expressed as the relative change compared with the expression level of each stage incubated under 22 ℃, asterisk (*) indicates significant difference (P<0.05), double asterisk (**) indicates significance at P<0.01

    3討論

    miR-146a最初被發(fā)現(xiàn)在miRNA中參與天然免疫應答,當單核細胞受到細菌內毒素侵襲時,miR-146a的表達顯著上調[19].近年來許多文獻報道,miR-146a調節(jié)的許多靶基因參與了細胞分化的作用,但這些研究主要集中在分析miR-146a對造血細胞的分化作用,而miR-146a對胚胎發(fā)育的作用暫未見到相關報道.Kuang等[10]的研究驗證了miR-146a能夠抑制Numb的表達.Numb是一種進化保守蛋白,其作為內源性細胞命運決定因子,對細胞分裂的命運起決定作用.Numb對胚胎早期神經(jīng)和肌肉的發(fā)育作用也已經(jīng)被證明[20-21].Numb作為一個重要的細胞命運決定蛋白,參與Notch的負性調控,兩者的平衡決定了細胞分化的方向[22].Notch信號轉導通路作為生物發(fā)育分化中高度保守的通路,通過與配體的相互作用產(chǎn)生級聯(lián)瀑布效應,參與細胞發(fā)育過程中分化方向的選擇,并對細胞的增殖及凋亡也起著重要的作用[23-24].Notch信號通路在胚胎發(fā)育中起到調節(jié)細胞增殖和決定細胞命運的作用[25].激活Notch信號能夠促進肌原細胞的增殖,并降低MyoD和myogenin的表達來延遲成肌細胞的分化[26].miR-146a及其靶基因的研究為進一步了解miR-146a在胚胎發(fā)育中潛在的作用提供了一些重要的理論依據(jù).

    翹嘴鱖miR-146a胚胎發(fā)育性表達結果顯示,在22 ℃和25 ℃水溫孵化下,miR-146a表達規(guī)律趨勢總體相似,但在不同溫度下,miR-146a的表達在幾個時期經(jīng)歷了微調,說明溫度確實影響了miR-146a的表達.本文結果顯示在胚胎發(fā)育早期(二細胞到神經(jīng)胚期)miR-146a的表達趨于穩(wěn)定且處于較高水平(除22 ℃神經(jīng)胚期有顯著性上升),在進入尾芽期后表達都顯著性地降低.Giraldez等[27]的研究表明miRNA的作用并不是在發(fā)育早期決定細胞的命運而是影響發(fā)育后期組織的發(fā)育和形成,而在神經(jīng)胚期前胚胎的大部分組織器官還未開始分化,本文結果與Giraldez等的結論相符.胚胎發(fā)育經(jīng)過神經(jīng)胚期后,是器官形成的主要階段,而本文結果顯示miR-146a的表達在尾芽期顯著降低,表明miR-146a的靶基因在這個階段后受到其抑制作用將明顯降低,并推測miR-146a的靶基因的作用可能是促進胚胎發(fā)育的.Kuang等[10]的研究發(fā)現(xiàn)Numb是miR-146a的靶基因,Numb能夠促進胚胎早期神經(jīng)和肌肉的發(fā)育[20-21],Numb參與調節(jié)的Notch信號通路也對胚胎的發(fā)育起到重要的作用.

    溫度是影響魚類胚胎發(fā)育的一個主要的外在因子.大量研究表明,在適宜溫度下,隨著水溫的升高,胚胎的發(fā)育進程加快,孵化所需時間縮短[28-29],但是miRNA的表達是否受到溫度的影響還未見相關報道.從圖2可以看出,在25 ℃孵化時,miR-146a在不同階段的表達都比22 ℃時出現(xiàn)顯著性降低.這一結果表明溫度升高能降低miR-146a的表達,從而調節(jié)胚胎的發(fā)育.有研究表明肌纖維增生和增粗的速率在較高的水溫孵化時都會升高,但是溫度對肌纖維的增粗效果強于增生[5].在25 ℃孵化時,miR-146a的表達顯著性降低能增強Numb對Notch信號通路的抑制作用,促進成肌細胞的分化,從而有利于胚胎中肌肉組織形成.這一結果表明了miR-146a在參與水溫調節(jié)胚胎發(fā)育的過程中是通過下調來促進發(fā)育的.

    4結論

    研究表明,miR-146a在胚胎發(fā)育早期(神經(jīng)期前)的作用不明顯.在胚胎發(fā)育后期(尾芽期至出膜),miR-146a通過下調其表達來促進胚胎的發(fā)育.而水溫升高能顯著降低miR-146a在胚胎發(fā)育每個時期的表達,減少其對靶基因Numb的抑制,發(fā)揮促進細胞分化的作用,從而有利于胚胎發(fā)育的進程.

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    (編輯王健)

    DevelopmentandEffectofTemperatureonMiR-146aExpression

    ZHU Xin1,2#, YI Tan1,2#, CHEN Lin1,WUPing1,WANGJian-hua1,

    CHEN Tao2,ZHANGJian-she1, CHU Wu-ying1*

    (1.DepartmentofBiologicalandEnvironmentalEngineering,ChangshaUniversity,Changsha410003,China;

    2.CollegeofVeterinaryMedicine,HunanAgricultureUniversity,Changsha410128,China)

    AbstractTo investigate the expression pattern of miR-146a in embryonic developmental stage and the effect of temperature on the expression of miR-146a in Siniperca chuatsi, the embryos were incubated under different temperatures and the expression of miR-146a during embryonic developmental stage was detected by RT-qPCR. The results showed that the expressions of miR-146a were at a higher level and there is no significant difference before gastrula stage when the embryos incubated under 22 ℃ (P>0.05). And then the expressions of miR-146a decreased after tail-bud stage and decreased to the lowest level at larval stage (P<0.05). When the embryos incubated under 25 ℃, the expressions of miR-146a were at a higher level and there is no significant difference till neurula stage (P>0.05). Once at tail-bud stage, the expression of miR-146a significantly decreased (P<0.05) and to the lowest level at muscular effect stage. It was interesting that the expressions of miR-146a were significantly decreased at each developmental stage incubated under 25 ℃ when compared with 22 ℃ incubation (P<0.05). The results indicated that miR-146a mainly involved in regulating embryonic development during later embryonic developmental stages and promoted embryonic development by down regulation its expression. In addition, the expressions of miR-146a could decrease when the incubation temperature increased, and miR-146a might involve in the effect of temperature on embryonic development of Siniperca chuatsi.

    Key wordsSiniperca chuatsi; miR-146a; developmental expression; embryonic development; temperature regulation

    中圖分類號Q752; S917.4

    文獻標識碼A

    文章編號1000-2537(2015)05-0021-06

    通訊作者*,E-mail:chuwuying18@sina.com

    基金項目:#本文同等貢獻作者.

    收稿日期:2014-12-15

    DOI:10.7612/j.issn.1000-2537.2015.05.004

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