內(nèi)嗎啡肽-2 的合成

趙紅玲，高楊，李云紅，尹志峰，王良友

(1.河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000;2.承德天創(chuàng)生物制品有限公司，河北 承德 067000)

內(nèi)嗎啡肽-2(EM-2)是一種具有鎮(zhèn)痛作用的四肽，其氨基酸序列為Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2，相對(duì)分子量(Mr)571.7。1997 年由美國(guó)新奧爾良市都藍(lán)大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)家Zadina 等［1］在牛腦中發(fā)現(xiàn)，它存在于動(dòng)物和人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，是內(nèi)源性L 阿片受體的激動(dòng)劑，具有高親和性和選擇性［2］。

文獻(xiàn)［3-4］采用液相二肽片段縮合的方法制備EM-2，步驟繁瑣，收率低。還有采用基因工程的方法將人源生長(zhǎng)因子信號(hào)肽與EM-2 融合表達(dá)［5］，成本高，不易放大。

本研究采用多肽固相合成法，按照內(nèi)嗎啡肽-2的肽序列，依次從C 端向N 端偶聯(lián)氨基酸，肽樹脂經(jīng)TFA 裂解得到粗肽，再經(jīng)反相高效制備液相純化轉(zhuǎn)鹽制備醋酸內(nèi)嗎啡肽-2。此合成工藝操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)品純度高，重復(fù)性好、收率高，適合于工業(yè)化放大生產(chǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

Rink Amid 樹脂(替代度0.80 mmol/g);Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Tyr(OtBu)-OH、1-羥基苯并三唑(HOBT)、N，N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、冰乙醚、二氯甲烷、三氟乙酸(TFA)均為分析純;乙腈，色譜純;氨基酸，標(biāo)準(zhǔn)品。

AR224CN 分析天平;HDFD-3 PSA 制氮機(jī);TDL-40B 高速大容量離心機(jī);SHZ-Ⅳ循環(huán)水多用真空泵;Heal Force Easy20 純水機(jī);Agilent 1200 反相高效液相-ESI 質(zhì)譜聯(lián)用儀;Newstyle NP7000 反相高效半制備液相色譜儀;LC98-I AAA 氨基酸分析系統(tǒng);CHRIST ALPHA 1-4 LD 型凍干機(jī)。

1.2 EM-2 肽樹脂的合成［6］

1.2.1 Rink 樹脂脫Fmoc 保護(hù) 把Rink Amide 樹脂1.259 g(1 mmol)投入到多肽反應(yīng)柱中，10 mL DMF 溶漲30 min，抽干液體;10 mL DMF 洗滌1 次。分別加入10 mL DBLK(20%哌啶的DMF 溶液)，脫除Fmoc 保護(hù)2 次，時(shí)間分別是10 min 和5 min，茚三酮檢測(cè)(Kaiser 法)陽(yáng)性。分別加入DMF、DCM、DMF 各5 mL，洗滌樹脂3 次。

1.2.2 氨基酸偶聯(lián) 稱取Fmoc-Phe-OH 1.165 g(3 mmol)、DIC 0. 557 mL (3. 6 mmol)和HOBt 0.486 g(3.6 mmol)10 mL DMF 溶解，加入到樹脂中，N2吹拂攪拌反應(yīng)2 h，茚三酮檢測(cè)陰性，抽濾去除反應(yīng)液。10 mL DMF 洗滌1 次，抽干。分別加入10 mL DBLK(20%哌啶的DMF 溶液)，脫除Fmoc 保護(hù)2 次，時(shí)間分別是10 min 和5 min，茚三酮檢測(cè)陽(yáng)性，分別加入DMF、DCM 和DMF 各5 mL，洗滌樹脂3 次。按照上述氨基酸脫保護(hù)與偶聯(lián)方法，依次偶聯(lián)Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH 和Fmoc-Tyr(OtBu)-OH。肽樹脂分別用DMF 洗滌3 次、二氯甲烷洗滌3次，每次洗滌1 min，再用甲醇收縮2 次，每次收縮10 min，抽干甲醇。得到流沙狀肽樹脂1.873 g。

1.3 肽鏈切割

向1 g 肽樹脂中緩緩加入10 mL－20 ℃預(yù)凍的三氟乙酸，室溫裂解1.5 h，濾除樹脂，將濾液緩慢滴加到60 mL 乙醚中，邊加邊攪拌，4 000 r/min 離心4 min，倒出上清液，下方沉淀經(jīng)乙醚洗4 次，真空減壓干燥，得到EM-2 粗肽0.644 g。

1.4 EM-2 純化與轉(zhuǎn)鹽

1.4.1 高效液相分析條件 色譜柱為Agela C18柱(4.6 mm×250 mm，10 μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm，流動(dòng)相:緩沖液A 為0. 1% TFA/H2O，B 為乙腈，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，洗脫條件B 項(xiàng)5% ～95%，為單一峰，出峰時(shí)間為11.891 min，粗肽純度為98.5%。

1.4.2 制備液相純化轉(zhuǎn)鹽 色譜柱為Hedera ODS-2 反相硅膠柱(20 mm ×250 mm，10 μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm，流動(dòng)相A 為0.3%醋酸/H2O，流動(dòng)相B 為乙腈，流速15 mL/min，進(jìn)樣量100 mL，洗脫梯度B:25% ～38%，分布收集，精肽出峰時(shí)間為11.837 min，純度為99.6%(見圖1)，冷凍干燥得到干粉0.516 g，得率為80.1%。

圖1 EM-2HPLC 精肽分析譜圖Fig.1 EM-2 HPLC peptide the fine spectra analysis

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜分析

精肽的ESI-MS 譜圖見圖2，［M + H］+=572.3，與理論值571.7 相符。

圖2 EM-2 的ESI-MS 測(cè)定譜圖Fig.2 EM-2 ESI-MS spectra

2.2 氨基酸組成分析［7］

2. 2. 1 EM-2 酸解衍生 稱取5 mg EM-2，放入10 mL安培瓶中，加入6 mol/L 鹽酸5 mL 混勻。氮?dú)獗Ｗo(hù)下封口，110 ℃水解24 h。水解液45 ℃減壓旋蒸濃縮至干，用0.1 mol/L 鹽酸5 mL 溶解。充分溶解后，取0.2 mL 水解液，加入0.1 mL 衍生劑Y(1.2%異硫氰酸苯酯的乙腈溶液)和0.1 mL 衍生劑S(13.9%三乙胺的乙腈溶液)，室溫靜置1 h。再加入0.4 mL 正己烷振蕩，靜置10 min，取下層清液稀釋5 倍進(jìn)樣檢測(cè)。

2.2.2 色譜分析條件 色譜柱為氨基酸分析專用ODS 柱，柱溫40 ℃，流速1 mL/min，波長(zhǎng)254 nm，梯度見表1。氨基酸組成分析結(jié)果(圖3、圖4)為:固相合成EM-2 的氨基酸種類、個(gè)數(shù)與Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2一致。

表1 梯度洗脫曲線Table 1 Gradient elution curves

圖3 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(A)與EM-2(B)的氨基酸組成分析譜圖Fig.3 Amino acid standard and EM-2 (A)(B)the amino acid composition analysis of spectra

2.3 放大實(shí)驗(yàn)

不同規(guī)模合成實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 放大重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 2 Repeat the experimental data

由表2 可知，實(shí)驗(yàn)易于放大，重復(fù)性好，收率高而且穩(wěn)定。

3 結(jié)論

內(nèi)嗎啡肽-2 可從動(dòng)物的組織中分離提取，獲得的量有限而且成本高;采用液相合成法制備，產(chǎn)品純度不高，收率低，滿足不了市場(chǎng)的需求。本研究采用多肽固相合成法，操作簡(jiǎn)便，易于放大，重復(fù)性好，收率高。本實(shí)驗(yàn)研究的固相合成工藝，對(duì)于內(nèi)嗎啡肽-2 的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的參考價(jià)值。

［1］ Zadina J E，Hackler L，Ge L J，et al.A potent and selective endogenous agonist for the L-opiate receptor［J］.Nature，1997，386:499-501.

［2］ Schild S M，Zadina J E，Gerall A A，et al.Localization of endomorphin-2 like immunoreactivity in the ratmedulla and spinal cord［J］.Peptides，1997，18(10):1641-1649.

［3］ 梁月潔，孟慶國(guó)，李明慧，等. 內(nèi)嗎啡肽-2 的合成研究［J］.煙臺(tái)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，20(1):19-21.

［4］ 李俊，陳鈞輝，聶永軍，等. 內(nèi)嗎啡肽-2 的人工合成及其酶促降解［J］. 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2004，20(2):270-274.

［5］ 吳飛翔，俞衛(wèi)峰，孫玉明.一種高效表達(dá)生產(chǎn)內(nèi)嗎啡肽-2 的方法及其應(yīng)用:CN，103320472A［P］.2013-06-19.

［6］ 高楊，趙紅玲，王小青，等.阿基瑞林的固相合成［J］.承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，31(5):420-421.

［7］ 王麗莉.多肽類藥物的氨基酸檢測(cè)方法［J］.科技創(chuàng)新與應(yīng)用，2014(16):272.