樺褐孔菌總?cè)铺崛」に嚨难芯?/h1>
2015-12-24 03:30:12戚月婷玄光善
應(yīng)用化工 2015年5期
戚月婷，玄光善
(青島科技大學(xué) 藥學(xué)系，山東 青島 266042)
樺褐孔菌(Inonotus obliquus)又名樺樹(shù)菇、西伯利亞靈芝，中文學(xué)名為白樺茸。在外文資料中，其學(xué)名常以Inonotus obliquus(Fr. )Pilat 出現(xiàn)［1］。樺褐孔菌是一種極其珍貴的藥用真菌，屬多孔菌科褐臥孔菌屬，是一種生長(zhǎng)在寒帶的木腐菌。樺褐孔菌菌核呈現(xiàn)瘤狀、無(wú)柄，外表黑色或黑褐色，內(nèi)部黃褐色，老后表面深裂，很硬，干時(shí)脆。野生樺褐孔菌生于白樺、銀樺等樹(shù)的活立木的樹(shù)皮下或砍伐后樹(shù)木的枯干上。樺褐孔菌主要分布在北緯45 ～50°的中國(guó)的黑龍江和吉林、波蘭、芬蘭、北美北部、俄羅斯、日本北海道等地。樺褐孔菌是俄羅斯及東歐地區(qū)一帶的民間藥用真菌，其有效成分已經(jīng)引起美國(guó)、韓國(guó)、日本等國(guó)科學(xué)家的高度重視。俄羅斯認(rèn)為，樺褐孔菌是上帝賜給苦難人類的禮物。日本的研究人員高度評(píng)價(jià)樺褐孔菌為“萬(wàn)能藥”。美國(guó)則把樺褐孔菌列入“特殊的天然物質(zhì)”，作為未來(lái)宇航員們的飲品。
隨著對(duì)樺褐孔菌化學(xué)成分的研究日漸深入，大量活性成分被分離出來(lái)，包括多糖、三萜類化合物、樺褐孔菌素、樺褐孔菌醇、栓菌酸、木質(zhì)素類和黑色素類等200 多種化學(xué)成分。研究發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌具有抗癌、防治糖尿病、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫、防治艾滋病等多種藥理作用［2］。三萜類化合物作為樺褐孔菌的一種主要活性成分，可用于惡性腫瘤、糖尿病、肝病、心血管疾病以及艾滋病的預(yù)防和治療［3］。研究發(fā)現(xiàn)，其主要有效成分為羊毛脂烷型四環(huán)三萜［4］。
三萜類化合物的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，而且性質(zhì)不太穩(wěn)定，溫度太高會(huì)破壞其結(jié)構(gòu);難溶于水，易溶于有機(jī)溶劑。根據(jù)相似相容的原理，可選用極性相近的異丙醇作為提取溶劑［5］。超聲波輔助提取法，作為一種新技術(shù)，是利用超聲波產(chǎn)生的高速、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)和攪拌作用，破壞藥材細(xì)胞，促進(jìn)溶劑滲透到藥材細(xì)胞中，大大縮短了提取時(shí)間。此技術(shù)效率高、節(jié)省溶劑，尤其對(duì)植物細(xì)胞壁內(nèi)活性物質(zhì)的提取具有優(yōu)勢(shì)［6］。本實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助-回流提取法提取樺褐孔菌總?cè)?，以獲得最佳提取工藝參數(shù)，為后續(xù)的純化分離及工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 材料與儀器
樺褐孔菌，購(gòu)于吉林長(zhǎng)白山，干燥、粉碎、過(guò)40目篩后保存;齊墩果酸對(duì)照品(Sigma 公司，純度＞98%);香草醛、冰醋酸、高氯酸、異丙醇等均為分析純。
FW100 型高速萬(wàn)能粉碎機(jī);HB-6 型磁力攪拌恒溫水浴鍋;RE-5 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;KH-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器;UV762 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
準(zhǔn)確稱取1.00 g 樺褐孔菌粉，按料液比1 ∶10 g/mL加入異丙醇，在90 Hz、50 ℃的條件下超聲30 min，然后加熱回流提取2 h。減壓過(guò)濾，濾液旋蒸除去溶劑。用甲醇定容至50 mL 容量瓶用于含量測(cè)定。
1.3 分析方法
1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以齊敦果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸分光光度法進(jìn)行總?cè)坪繙y(cè)定［7-8］。準(zhǔn)確稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，置于50 mL 容量瓶，用甲醇稀釋至刻度，并搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。準(zhǔn)確移取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0，0. 10，0. 20，0. 30，0. 40，0.50，0.60，0.70 mL，分別加入10 mL 具塞試管中，水浴揮盡溶劑，然后加入0.3 mL 新鮮配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%香草醛-冰醋酸溶液和1 mL 高氯酸，60 ℃水浴中反應(yīng)20 min，流水冷卻至室溫，加冰醋酸至10 mL，搖勻，在550 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。以齊墩果酸質(zhì)量x 為橫坐標(biāo)，吸光度y 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。
圖1 三萜類化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of triterpenoids
由圖1 可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y =3.524 6x－0.002 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2。結(jié)果表明，齊墩果酸在0 ～0.14 mg 范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。
1.3.2 含量測(cè)定 準(zhǔn)確移取0.1 mL 提取液，水浴揮干，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作方法測(cè)定樣品在550 nm 波長(zhǎng)時(shí)的吸光度。
2 結(jié)果與討論
2.1 定性分析
三萜類化合物的定性分析采用氯仿-濃硫酸顯色反應(yīng)［9］，取一定量的樺褐孔菌異丙醇提取物，溶于氯仿，加入濃硫酸，氯仿層呈現(xiàn)紅色，說(shuō)明有三萜類化合物存在。將氯仿層點(diǎn)樣在濾紙上，在254 nm的紫外分析儀下可以觀察到綠色熒光現(xiàn)象，說(shuō)明提取液中有三萜類化合物存在。
2.2 單因素實(shí)驗(yàn)
2.2.1 物料比對(duì)總?cè)频寐实挠绊?物料比對(duì)總?cè)频寐实挠绊?，?jiàn)圖2。
圖2 物料比對(duì)總?cè)频寐实挠绊慒ig.2 Effects of material-liquid ratio on the yield of total triterpenoids
由圖2 可知，隨著物料比逐漸增大，總?cè)频寐氏仍龃蠛鬁p小，在物料比為1∶10 g/mL 時(shí)，達(dá)到最大值。2.2.2 提取溫度對(duì)總?cè)频寐实挠绊?提取溫度對(duì)總?cè)频寐实挠绊?，?jiàn)圖3。
圖3 提取溫度對(duì)總?cè)频寐实挠绊慒ig.3 Effects of extraction temperature on the yield of total triterpenoids
由圖3 可知，隨著溫度的不斷升高，總?cè)频寐孰S之增加，70 ℃時(shí)，得率最高。在70 ～90 ℃的溫度范圍內(nèi)，得率相對(duì)穩(wěn)定。過(guò)高的溫度會(huì)對(duì)三萜類化合物造成破壞。所以最佳提取溫度選擇80 ℃。
2.2.3 提取時(shí)間對(duì)總?cè)频寐实挠绊?提取時(shí)間對(duì)總?cè)频寐实挠绊?，?jiàn)圖4。
圖4 提取時(shí)間對(duì)總?cè)频寐实挠绊慒ig.4 Effects of extraction time on the yield of total triterpenoids
由圖4 可知，總?cè)频寐孰S提取時(shí)間的延長(zhǎng)先增大后減小，2 h 時(shí)達(dá)到最大值。原因可能是，提取時(shí)間＞2 h 后，雜質(zhì)也會(huì)被溶出到提取溶劑中。
2.2.4 提取次數(shù)對(duì)總?cè)频寐实挠绊?提取次數(shù)對(duì)總?cè)频寐实挠绊?，?jiàn)表1。
表1 提取次數(shù)對(duì)總?cè)频寐实挠绊慣able 1 Effect of extraction times on the yield of total triterpenoids
由表1 可知，第一次提取的得率比較高，第二次及第三次的得率低很多。而且，多次提取會(huì)嚴(yán)重浪費(fèi)時(shí)間和能源，也增加了后續(xù)濃縮工藝的難度。因此，提取1 次即可。
2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果
在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以總?cè)频寐蕿榭疾熘笜?biāo)，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。因素水平見(jiàn)表2，結(jié)果見(jiàn)表3。
表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test
表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of orthogonal test
由表3 可知，影響樺褐孔菌總?cè)频寐实囊蛩爻潭却笮∫来螢锳 ＞B ＞C，即物料比＞提取溫度＞提取時(shí)間。最優(yōu)組合為A2B3C3，即10 倍量異丙醇、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間2.5 h。
考慮到提取時(shí)間對(duì)總?cè)频寐实挠绊懽钚。遥? h 后，總?cè)频寐薀o(wú)明顯增加，從節(jié)約時(shí)間和能源的角度考慮，工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)可采用10 倍量異丙醇，提取溫度80 ℃，提取時(shí)間2 h。
2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
為進(jìn)一步考察最優(yōu)提取工藝的穩(wěn)定性，在該條件下，即物料比1∶10 g/mL、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間2 h，進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of proof test
由表4 可知，平均得率為1.42%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為2.14%，數(shù)據(jù)相對(duì)穩(wěn)定，表明該最佳提取工藝合理可行。
3 結(jié)論
用異丙醇提取樺褐孔菌總?cè)频淖罴压に嚍?料液比1∶10 g/mL，提取溫度80 ℃，提取時(shí)間2 h。采用該提取工藝提取樺褐孔菌總?cè)?，其得率可達(dá)1.42%。
［1］ 黃年來(lái).俄羅斯神秘的民間藥用真菌-樺褐孔菌［J］.中國(guó)食用菌，2002，21(4):7-8.
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［3］ 張小青，戴玉成. 中國(guó)真菌志(銹革孔菌科)［M］. 北京:科學(xué)出版社，2005:92-93.
［4］ 麥勤勤，陳寅生，程麗紅，等.樺褐孔菌中羊毛脂烷型三萜系列化合物的探討［J］. 河南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2013，32(2):112-116.
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［6］ Vinatoru M.An overview of the ultrasonically assisted extraction of bioactive principles from herbs［J］.Ultrasonics Sonochemistry，2001(8):303-313.
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［9］ 吳立軍. 天然藥物化學(xué)［M］. 北京:人民衛(wèi)生出版社，2009:287.
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(青島科技大學(xué) 藥學(xué)系，山東 青島 266042)
樺褐孔菌(Inonotus obliquus)又名樺樹(shù)菇、西伯利亞靈芝，中文學(xué)名為白樺茸。在外文資料中，其學(xué)名常以Inonotus obliquus(Fr. )Pilat 出現(xiàn)［1］。樺褐孔菌是一種極其珍貴的藥用真菌，屬多孔菌科褐臥孔菌屬，是一種生長(zhǎng)在寒帶的木腐菌。樺褐孔菌菌核呈現(xiàn)瘤狀、無(wú)柄，外表黑色或黑褐色，內(nèi)部黃褐色，老后表面深裂，很硬，干時(shí)脆。野生樺褐孔菌生于白樺、銀樺等樹(shù)的活立木的樹(shù)皮下或砍伐后樹(shù)木的枯干上。樺褐孔菌主要分布在北緯45 ～50°的中國(guó)的黑龍江和吉林、波蘭、芬蘭、北美北部、俄羅斯、日本北海道等地。樺褐孔菌是俄羅斯及東歐地區(qū)一帶的民間藥用真菌，其有效成分已經(jīng)引起美國(guó)、韓國(guó)、日本等國(guó)科學(xué)家的高度重視。俄羅斯認(rèn)為，樺褐孔菌是上帝賜給苦難人類的禮物。日本的研究人員高度評(píng)價(jià)樺褐孔菌為“萬(wàn)能藥”。美國(guó)則把樺褐孔菌列入“特殊的天然物質(zhì)”，作為未來(lái)宇航員們的飲品。
隨著對(duì)樺褐孔菌化學(xué)成分的研究日漸深入，大量活性成分被分離出來(lái)，包括多糖、三萜類化合物、樺褐孔菌素、樺褐孔菌醇、栓菌酸、木質(zhì)素類和黑色素類等200 多種化學(xué)成分。研究發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌具有抗癌、防治糖尿病、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫、防治艾滋病等多種藥理作用［2］。三萜類化合物作為樺褐孔菌的一種主要活性成分，可用于惡性腫瘤、糖尿病、肝病、心血管疾病以及艾滋病的預(yù)防和治療［3］。研究發(fā)現(xiàn)，其主要有效成分為羊毛脂烷型四環(huán)三萜［4］。
三萜類化合物的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，而且性質(zhì)不太穩(wěn)定，溫度太高會(huì)破壞其結(jié)構(gòu);難溶于水，易溶于有機(jī)溶劑。根據(jù)相似相容的原理，可選用極性相近的異丙醇作為提取溶劑［5］。超聲波輔助提取法，作為一種新技術(shù)，是利用超聲波產(chǎn)生的高速、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)和攪拌作用，破壞藥材細(xì)胞，促進(jìn)溶劑滲透到藥材細(xì)胞中，大大縮短了提取時(shí)間。此技術(shù)效率高、節(jié)省溶劑，尤其對(duì)植物細(xì)胞壁內(nèi)活性物質(zhì)的提取具有優(yōu)勢(shì)［6］。本實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助-回流提取法提取樺褐孔菌總?cè)?，以獲得最佳提取工藝參數(shù)，為后續(xù)的純化分離及工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 材料與儀器
樺褐孔菌，購(gòu)于吉林長(zhǎng)白山，干燥、粉碎、過(guò)40目篩后保存;齊墩果酸對(duì)照品(Sigma 公司，純度＞98%);香草醛、冰醋酸、高氯酸、異丙醇等均為分析純。
FW100 型高速萬(wàn)能粉碎機(jī);HB-6 型磁力攪拌恒溫水浴鍋;RE-5 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;KH-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器;UV762 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
準(zhǔn)確稱取1.00 g 樺褐孔菌粉，按料液比1 ∶10 g/mL加入異丙醇，在90 Hz、50 ℃的條件下超聲30 min，然后加熱回流提取2 h。減壓過(guò)濾，濾液旋蒸除去溶劑。用甲醇定容至50 mL 容量瓶用于含量測(cè)定。
1.3 分析方法
1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以齊敦果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸分光光度法進(jìn)行總?cè)坪繙y(cè)定［7-8］。準(zhǔn)確稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，置于50 mL 容量瓶，用甲醇稀釋至刻度，并搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。準(zhǔn)確移取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0，0. 10，0. 20，0. 30，0. 40，0.50，0.60，0.70 mL，分別加入10 mL 具塞試管中，水浴揮盡溶劑，然后加入0.3 mL 新鮮配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%香草醛-冰醋酸溶液和1 mL 高氯酸，60 ℃水浴中反應(yīng)20 min，流水冷卻至室溫，加冰醋酸至10 mL，搖勻，在550 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。以齊墩果酸質(zhì)量x 為橫坐標(biāo)，吸光度y 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。
圖1 三萜類化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of triterpenoids
由圖1 可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y =3.524 6x－0.002 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2。結(jié)果表明，齊墩果酸在0 ～0.14 mg 范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。
1.3.2 含量測(cè)定 準(zhǔn)確移取0.1 mL 提取液，水浴揮干，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作方法測(cè)定樣品在550 nm 波長(zhǎng)時(shí)的吸光度。
2 結(jié)果與討論
2.1 定性分析
三萜類化合物的定性分析采用氯仿-濃硫酸顯色反應(yīng)［9］，取一定量的樺褐孔菌異丙醇提取物，溶于氯仿，加入濃硫酸，氯仿層呈現(xiàn)紅色，說(shuō)明有三萜類化合物存在。將氯仿層點(diǎn)樣在濾紙上，在254 nm的紫外分析儀下可以觀察到綠色熒光現(xiàn)象，說(shuō)明提取液中有三萜類化合物存在。
2.2 單因素實(shí)驗(yàn)
2.2.1 物料比對(duì)總?cè)频寐实挠绊?物料比對(duì)總?cè)频寐实挠绊?，?jiàn)圖2。
圖2 物料比對(duì)總?cè)频寐实挠绊慒ig.2 Effects of material-liquid ratio on the yield of total triterpenoids
由圖2 可知，隨著物料比逐漸增大，總?cè)频寐氏仍龃蠛鬁p小，在物料比為1∶10 g/mL 時(shí)，達(dá)到最大值。2.2.2 提取溫度對(duì)總?cè)频寐实挠绊?提取溫度對(duì)總?cè)频寐实挠绊?，?jiàn)圖3。
圖3 提取溫度對(duì)總?cè)频寐实挠绊慒ig.3 Effects of extraction temperature on the yield of total triterpenoids
由圖3 可知，隨著溫度的不斷升高，總?cè)频寐孰S之增加，70 ℃時(shí)，得率最高。在70 ～90 ℃的溫度范圍內(nèi)，得率相對(duì)穩(wěn)定。過(guò)高的溫度會(huì)對(duì)三萜類化合物造成破壞。所以最佳提取溫度選擇80 ℃。
2.2.3 提取時(shí)間對(duì)總?cè)频寐实挠绊?提取時(shí)間對(duì)總?cè)频寐实挠绊?，?jiàn)圖4。
圖4 提取時(shí)間對(duì)總?cè)频寐实挠绊慒ig.4 Effects of extraction time on the yield of total triterpenoids
由圖4 可知，總?cè)频寐孰S提取時(shí)間的延長(zhǎng)先增大后減小，2 h 時(shí)達(dá)到最大值。原因可能是，提取時(shí)間＞2 h 后，雜質(zhì)也會(huì)被溶出到提取溶劑中。
2.2.4 提取次數(shù)對(duì)總?cè)频寐实挠绊?提取次數(shù)對(duì)總?cè)频寐实挠绊?，?jiàn)表1。
表1 提取次數(shù)對(duì)總?cè)频寐实挠绊慣able 1 Effect of extraction times on the yield of total triterpenoids
由表1 可知，第一次提取的得率比較高，第二次及第三次的得率低很多。而且，多次提取會(huì)嚴(yán)重浪費(fèi)時(shí)間和能源，也增加了后續(xù)濃縮工藝的難度。因此，提取1 次即可。
2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果
在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以總?cè)频寐蕿榭疾熘笜?biāo)，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。因素水平見(jiàn)表2，結(jié)果見(jiàn)表3。
表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test
表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of orthogonal test
由表3 可知，影響樺褐孔菌總?cè)频寐实囊蛩爻潭却笮∫来螢锳 ＞B ＞C，即物料比＞提取溫度＞提取時(shí)間。最優(yōu)組合為A2B3C3，即10 倍量異丙醇、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間2.5 h。
考慮到提取時(shí)間對(duì)總?cè)频寐实挠绊懽钚。遥? h 后，總?cè)频寐薀o(wú)明顯增加，從節(jié)約時(shí)間和能源的角度考慮，工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)可采用10 倍量異丙醇，提取溫度80 ℃，提取時(shí)間2 h。
2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
為進(jìn)一步考察最優(yōu)提取工藝的穩(wěn)定性，在該條件下，即物料比1∶10 g/mL、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間2 h，進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of proof test
由表4 可知，平均得率為1.42%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為2.14%，數(shù)據(jù)相對(duì)穩(wěn)定，表明該最佳提取工藝合理可行。
3 結(jié)論
用異丙醇提取樺褐孔菌總?cè)频淖罴压に嚍?料液比1∶10 g/mL，提取溫度80 ℃，提取時(shí)間2 h。采用該提取工藝提取樺褐孔菌總?cè)?，其得率可達(dá)1.42%。
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