培養(yǎng)皿培養(yǎng)對牛樟芝生長特性及其總?cè)坪康挠绊?

馮路瑤，程顯好**，李 寅，劉鳳紅，李維煥，劉 靜

（1.魯東大學(xué)菌物科學(xué)與技術(shù)研究院山東省食用菌技術(shù)重點實驗室，山東 煙臺 264025；2.煙臺市中醫(yī)院腫瘤科，山東 煙臺 264000）

培養(yǎng)皿培養(yǎng)對牛樟芝生長特性及其總?cè)坪康挠绊?

馮路瑤1，程顯好1**，李 寅2，劉鳳紅1，李維煥1，劉 靜1

（1.魯東大學(xué)菌物科學(xué)與技術(shù)研究院山東省食用菌技術(shù)重點實驗室，山東 煙臺 264025；2.煙臺市中醫(yī)院腫瘤科，山東 煙臺 264000）

為探討牛樟芝（Antrodia camphorata）在固體培養(yǎng)基上的生長特性，采用固體瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)牛樟芝，觀測不同培養(yǎng)基、不同碳源和不同氮源對牛樟芝生長、菌絲形態(tài)、菌絲中總?cè)坪康挠绊?。牛樟芝?種不同培養(yǎng)基上的生長速度差別較大，菌絲形態(tài)也有差異。胡蘿卜培養(yǎng)基、GPY培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基和PDA加富培養(yǎng)基是比較適合于牛樟芝的固體培養(yǎng)基。在胡蘿卜培養(yǎng)基、GPY培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌絲中總?cè)坪枯^高。牛樟芝對所試不同碳源均可利用，在果糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露糖、木糖、木糖醇為碳源的培養(yǎng)基上生長較好，但在葡萄糖、麥芽糖、甘露糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲中三萜類成分含量更高。除了在以尿素為氮源的培養(yǎng)基上不生長之外，在其他所試氮源培養(yǎng)基上菌絲生長速度和菌絲形態(tài)有較大差別，在硫酸銨和魚蛋白胨為氮源的培養(yǎng)上菌絲三萜類成分含量更高。

牛樟芝；固體培養(yǎng)；總?cè)疲惶荚?；氮?/p>

牛樟芝（Antrodia camphorata）又名牛樟菇、樟窟內(nèi)菇、紅樟芝，隸屬擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina） 層菌綱（Hymenomycetes） 多孔菌目（Polyporales）多孔菌科（Polyporaceae）薄孔菌屬（Antrodia）。是一種原產(chǎn)于臺灣的珍稀藥用菌[1]。牛樟芝含有豐富的活性物質(zhì)，主要的活性成分是三萜類化合物；具有多種生物活性，如保肝、調(diào)節(jié)免疫、抑制血管新生、抗腫瘤、抗炎癥、抗氧化、降血壓等[2]。

樟芝是臺灣特有的菌種，牛樟樹是其惟一的寄主。由于樟芝可造成牛樟樹中心空洞腐朽，加上人們對牛樟樹的亂砍亂伐，致使牛樟樹資源相當(dāng)稀少。近百年來，牛樟樹難得一見，而能夠長出牛樟芝的牛樟樹則更少。因此樟芝十分珍貴，在臺灣民間視若珍寶，被稱為臺灣森林中的紅寶石[3]。

目前，牛樟芝的培養(yǎng)方式主要有液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)兩大類。液體培養(yǎng)可以在較短時間內(nèi)獲得大量的菌絲體和發(fā)酵液，能極大地提高產(chǎn)量，彌補樟芝生長緩慢這個缺點，但是其活性產(chǎn)物的含量較低。而固體培養(yǎng)主要有椴木培養(yǎng)、菌包培養(yǎng)、培養(yǎng)皿培養(yǎng)等方法[4]。用牛樟樹椴木培養(yǎng)可以得到質(zhì)量較高的牛樟芝子實體，但因為其生長極其緩慢、生產(chǎn)周期較長，而且牛樟樹為臺灣一級保護樹種，資源有限，這些都極大地限制了樟芝的產(chǎn)量[5]。

雖然目前已有牛樟芝固體培養(yǎng)的研究報道，但對于不同的常用真菌固體培養(yǎng)基上牛樟芝菌絲所含三萜類活性物質(zhì)的含量尚未見報道。本實驗主要通過皿培方式，研究了牛樟芝菌絲在不同的固體培養(yǎng)基上的生長特性，以及不同營養(yǎng)條件下牛樟芝菌絲的總?cè)坪俊?/p>

1 材料與方法

1.1材料

牛樟芝菌種，由山東省食用菌技術(shù)重點實驗室保存于PDA培養(yǎng)基上。

1.2試劑

淀粉、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露糖、木糖、甘油、山梨醇、甘露醇、木糖醇、魚蛋白胨、牛肉蛋白胨、酵母粉、酵母膏、硫酸鎂、硫酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硝酸鈉、VB1、齊墩果酸、高氯酸、冰醋酸、甲醇、香草醛等。其中試劑類為國產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

1.3培養(yǎng)基

麥芽汁培養(yǎng)基：每1升麥芽汁（手持糖量計測折光5.0）加入瓊脂15g，pH自然。

PDA加富培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g·L-1（煮汁）、KH2PO41 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、MgSO40.5 g·L-1、酵母粉5 g·L-1、VB10.1 g·L-1、瓊脂15 g·L-1，pH自然。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g·L-1（煮汁）、葡萄糖20 g·L-1、瓊脂15 g·L-1，pH自然。

胡蘿卜培養(yǎng)基：胡蘿卜200 g·L-1（煮汁）、葡萄糖20 g·L-1、瓊脂15 g·L-1，pH自然。

GPC培養(yǎng)基：葡萄糖20 g·L-1、蛋白胨6 g·L-1、玉米漿10 g·L-1、瓊脂15 g·L-1，pH自然。

GPY培養(yǎng)基：葡萄糖20 g·L-1、蛋白胨6 g·L-1、酵母膏10 g·L-1、瓊脂15 g·L-1，pH自然。

1.4培養(yǎng)方法

采用PDA加富培養(yǎng)基對保存的菌種進行活化，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d，備用。用直徑8 mm的打孔器在長好的平板上均勻打孔，將每一小塊牛樟芝菌種接種至不同培養(yǎng)基中央，于28℃暗培養(yǎng)，定期觀察生長情況和菌落特征，測定菌落的擴散直徑。

1.5牛樟芝利用碳源實驗

在GPY培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別用2%的以下碳源代替2%的葡萄糖[6]：淀粉、麥芽糖、蔗糖、果糖、甘露糖、木糖、乳糖、甘油、山梨醇、甘露醇、木糖醇等，制成固體培養(yǎng)基平板。接種后28℃恒溫暗培養(yǎng)，定期觀察生長情況和菌落特征，測定菌落擴散直徑。

1.6牛樟芝利用氮源實驗

在GPY培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，分別用0.6%的以下氮源代替0.6%的蛋白胨：動物性氮源（魚蛋白胨、牛肉蛋白胨），無機氮源采用0.2%的硝酸鈉、硫酸銨。尿素試驗采用0.2%的加量[6]。接種后于28℃恒溫暗培養(yǎng)，定期觀察生長情況和菌落特征，測定菌落擴散直徑。

1.7不同碳源、氮源對牛樟芝菌絲干重的影響

在不同碳源、不同氮源培養(yǎng)基上接種牛樟芝菌種后，28℃暗培養(yǎng)50 d，菌絲體在培養(yǎng)基表面形成一層可剝離的密實菌絲層，測定菌絲的濕重，然后于60℃干燥至恒重，測定菌絲的干重。

1.8牛樟芝菌絲體中總?cè)坪康臏y定

在不同培養(yǎng)基和不同碳源、不同氮源培養(yǎng)基上接種牛樟芝菌種后，28℃暗培養(yǎng)2個月，菌絲體在培養(yǎng)基表面形成一層可剝離的菌絲層，用不銹鋼鑷子仔細從培養(yǎng)基上將菌絲剝離下來，60℃干燥至恒重，測定總?cè)频暮俊?/p>

樣品溶液：取菌絲粉樣品0.5 g于50 mL容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度，超聲波（40 kHz）提取2 h[7]，提取過程中經(jīng)常搖動，3 200 r·min-1離心10 min，取上清液備用。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取齊墩果酸10 mg，置于50 mL容量瓶，加甲醇定容至刻度，配置成濃度為0.2mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液[8]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：準(zhǔn)確取濃度為0.2mg·mL-1的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.50 mL、0.60 mL，分別放于具塞磨口試管中，然后用沸水浴加熱揮發(fā)去溶劑。在每個試管中加入0.10 mL的5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，加塞。于60℃水浴恒溫加熱20 min，取出后立即用冰水冷卻，分別加冰醋酸5 mL，搖勻，在550 nm處分別測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，齊墩果酸質(zhì)量為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線[8]。

樣品溶液的測定：取樣品溶液各0.3 mL，置于5個磨口試管中，沸水蒸干溶劑，按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定吸光度值，計算牛樟芝菌絲中的總?cè)坪俊?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1牛樟芝菌絲在不同培養(yǎng)基上的生長情況

6種培養(yǎng)基中，胡蘿卜培養(yǎng)基、GPY培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基和PDA加富培養(yǎng)基比較適合于牛樟芝的固體培養(yǎng)。牛樟芝菌絲的生長情況見圖1和表1。

圖1 在不同培養(yǎng)基上牛樟芝菌絲生長情況Fig.1 Growth condition of Antrodia camphorata cultured on different media

表1 在不同培養(yǎng)基中的牛樟芝菌絲生長情況Tab.1 Growth condition of Antrodia camphorata cultured on different media

從圖1、表1可以看出，除麥芽汁培養(yǎng)基外，牛樟芝菌絲在PDA培養(yǎng)基、PDA加富培養(yǎng)基、胡蘿卜培養(yǎng)基、GPY培養(yǎng)基、GPC培養(yǎng)基上的菌絲形態(tài)沒有太大的差別，菌絲的生長速度也相對差不多，僅在不同培養(yǎng)時期菌絲的顏色變化上有所區(qū)別。牛樟芝菌絲在生長初期，接種塊上的顏色有所不同：在GPY培養(yǎng)基、GPC培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基上接種塊菌絲為白色，在胡蘿卜培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基和PDA加富培養(yǎng)基上接種塊菌絲為粉色或橘紅色。

2.2碳源對牛樟芝菌絲生長的影響

不同碳源對牛樟芝菌絲生長情況影響見表2。

從表2看出，牛樟芝菌絲對碳源的適應(yīng)性很強，在不同碳源條件下都可以生長，不同碳源條件下其生長速度為：木糖醇＞木糖＞甘露糖＞葡萄糖＞麥芽糖＞果糖＞山梨醇＞甘露醇＞甘油＞乳糖＞蔗糖＞淀粉。

在所試碳源中，以果糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露糖、木糖、木糖醇作為碳源時，生長的菌絲較發(fā)達，菌絲相對較致密。在以葡萄糖、木糖、木糖醇、甘露糖為碳源時，牛樟芝菌絲老化較快，顏色變化也比較明顯。以淀粉和蔗糖為碳源時，菌絲形態(tài)最為特殊，菌絲生長速度慢，而且菌絲呈白色，且比較稀疏。以淀粉為碳源時接種塊為黑色。

2.3氮源對牛樟芝菌絲生長的影響

不同氮源條件下牛樟芝菌絲生長情況見表3。

表2 在不同碳源條件下牛樟芝菌絲生長情況Tab.2 Growth condition of Antrodia camphorata cultured on different carbon sources

表3 不同氮源條件下牛樟芝菌絲生長情況Tab.3 Growth condition of Antrodia camphorata cultured on different nitrogen sources

由表3可見，在不同有機氮源培養(yǎng)基上牛樟芝菌絲生長速度有較明顯差異，但在以牛肉蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上，菌絲形態(tài)有較明顯差異，菌絲濃密、較厚。在無機氮源條件下生長時，與硝酸鈉、硫酸銨和尿素為氮源相比較，硝酸鈉和硫酸銨都比較適合牛樟芝菌絲生長，但菌絲老化較快；以尿素為氮源未見到肉眼可辨的生長。

2.4不同碳源、氮源對牛樟芝菌絲干重的影響

不同碳源對菌絲干重的影響見表4和表5。

表4 不同碳源對牛樟芝菌絲干重的影響Tab.4 Effect of different carbon sources on mycelia dry weight of Antrodia camphorata

由表4、表5可見，不同碳源、氮源對牛樟芝菌絲干重?zé)o明顯影響。牛樟芝菌絲在以葡萄糖、蔗糖、甘露醇、乳糖為碳源的培養(yǎng)基生長時，含水量較高。在以牛肉蛋白胨、魚蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基生長時，含水量也較高。由此得出，牛樟芝菌絲對甘油、木糖醇、甘露糖、山梨醇、硫酸銨、硝酸鈉利用較好。

2.5牛樟芝菌絲體中總?cè)坪?/p>

牛樟芝菌絲體中的三萜類成分有特征性紫外吸收峰，用紫外分光光度法測定不同培養(yǎng)基、不同碳源、氮源條件下牛樟芝菌絲中的總?cè)坪浚Y(jié)果見表6～表8。

在不同培養(yǎng)基上，牛樟芝菌絲中總?cè)坪坑忻黠@差異：在GPY培養(yǎng)基中總?cè)坪孔罡?；在GPC培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基中總?cè)坪孔畹停辉谄渌囵B(yǎng)基中總?cè)坪繜o明顯差異；在麥芽汁培養(yǎng)基中，基本不含三萜類成分（表6）。

表5 不同氮源對牛樟芝菌絲干重的影響Tab.5 Effect of different nitrogen sources on mycelia dry weight of Antrodia camphorata

表6 不同培養(yǎng)基中牛樟芝菌絲體中總?cè)坪縏ab.6 Content of total triterpenes of Antrodia camphorata on different media

表7 不同碳源條件下牛樟芝菌絲體中總?cè)坪縏ab.7 Content of total triterpenes of Antrodia camphorata on different carbon sources

表8 不同氮源條件下牛樟芝菌絲體中總?cè)坪縏ab.8 Content of total triterpenes of Antrodia camphorata on different nitrogen sources

在不同碳源條件下，牛樟芝菌絲在以葡萄糖、麥芽糖、甘露糖為碳源的培養(yǎng)基中，總?cè)坪枯^高，其他均無明顯差異（表7）。

在不同氮源條件下，以魚蛋白胨和硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基中牛樟芝菌絲總?cè)坪枯^高，以牛肉蛋白胨和硝酸鈉為氮源的培養(yǎng)基中含量較低，以尿素為氮源的培養(yǎng)基中未見肉眼可見生長（表8）。

3 討論

牛樟芝生長速度較慢，在不同的固體培養(yǎng)基上均能生長，菌絲形態(tài)有較大差異。三萜類物質(zhì)作為牛樟芝的主要活性物質(zhì)，在不同培養(yǎng)基中生長測得的含量有明顯不同，可能與不同營養(yǎng)成分對三萜類物質(zhì)合成所發(fā)揮的作用有關(guān)。

牛樟芝對碳源、氮源的利用較廣泛[1]，對不同碳源和不同氮源均能利用，但生長速度差別大，表明牛樟芝對不同的碳源、氮源的利用有較明顯的差異。菌絲形態(tài)在個別碳源、氮源條件下有較明顯的不同。在以尿素為氮源的培養(yǎng)基上未見肉眼可辨生長，原因可能是樟芝菌缺乏尿素酶，不能有效利用尿素氮。使用無機氮為氮源時,菌絲必須利用無機氮合成自身所需要的氨基酸，而某些氨基酸幾乎不能生物合成，從而影響樟芝菌絲的生長[2]。在不同碳源、氮源條件下，牛樟芝菌絲中總?cè)坪康牟町愐草^明顯。

[1]宋愛榮.臺灣樟芝對碳素營養(yǎng)源利用的研究[J].中國食用菌，2004，21（5）：41-43.

[2]Geng Yan,He Zhe,Lu Zhen-Ming,et al.Antrodia camphorata ATCC 200183 sporulates asexually in submerged culture[J].Appl.Microbiol.Biotechnol.,2013,97(7):2851-2858.

[3]宋愛榮.樟芝對氮素營養(yǎng)源利用的研究[J].菌物研究，2004，2（1）：45-48.

[4]徐泰浩，林芳儀.臺灣地區(qū)樟芝研究概況與發(fā)展趨勢[J].食藥用菌，2011，19（6）：24-29.

[5]姚秀英.牛樟芝人工培養(yǎng)條件的初步研究[D].濟南：山東師范大學(xué)，2011.

[6]程顯好，郭順星.豬苓菌絲固體培養(yǎng)特性研究[J].中藥材，2009，32（1）：11-14.

[7]王光磊，洪華煒，王宮.幾種提取技術(shù)在樟芝總?cè)铺崛≈械膽?yīng)用和比較[J].海峽藥學(xué)，2014，26（8）：31-33.

[8]王紅梅，劉海燕，林淼，等.靈芝孢子粉中總?cè)坪繕?biāo)準(zhǔn)測定方法的改進[J].食用菌學(xué)報，2013，20（2）：42-45.

Cultural Characteristics and Content of Total Triterpenes of Antrodia camphorata on Solid Media

FENG Lu-yao1,CHENG Xian-hao1,LI Yan2,LIU Feng-hong1,LI Wei-huan1,LIU Jing1
(1.Institute of Mycological Science and Techology,Shandong Key Lab of Edible Mushroom Technology,Ludong University, Yantai 264025,China;2.Yantai City Hospital Oncology Department,Yantai 264000,China)

To explore the cultural characteristics of Antrodia camphorata on solid media,A.camphorata was cultured on solid agar medium.Effects of different media,carbon sources,and nitrogen sources on growth and morphology of A.camphorata were observed,and the effects to the content of total triterpenes of A.camphorate were explored.The growth velocity and morphology of A.camphorata were different in various media.Carrot media,GPY media,PDA media and PDA enrichment media were suitable for solid culture.The content of total triterpenes of A.camphorata on carrot media and GPY media were higher than in other media.Different carbon sources could be utilized by A.camphorate.A.camphorata grew better when fructose,maltose, mannose,xylose,xylitol as carbon sources in submerged culture conditions.The content of total triterpenes of A.camphorata was higher when glucose,maltose,mannose as carbon sources.Better adaptability to nitrogen source except for urea were observed in A.camphorate.A.camphorata has not grown when urea as nitrogen source.The growth velocity and morphology of A.camphorata were different in various nitrogen sources.The content of total triterpenes of A.camphorata was higher taking ammonium sulphate and fish peptone as nitrogen sources.

Antrodia camphorata;solid-state culture;total triterpenes;carbon source;nitrogen source

S646.9

A

1003-8310（2015）04-0031-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.04.007

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系食用菌產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊資助項目（SDAIT-11-011-11）。

馮路瑤（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向為菌物生態(tài)學(xué)。E-mail:fengluyaojy@sohu.com

**通信作者：程顯好（1966-），男，博士，教授，主要從事菌物生態(tài)學(xué)和食（藥）用真菌產(chǎn)品研發(fā)工作。E-mail:chengxianhao@sohu.com

2015-05-19