大孔吸附樹脂純化石榴花多酚的工藝

張立華　董業(yè)成　張元湖

摘要：通過靜態(tài)吸附與解吸試驗對5種大孔吸附樹脂進行篩選，結(jié)果表明：X-5型樹脂對石榴花多酚表現(xiàn)出最好的吸附性能與解吸效果，適宜作為純化石榴花多酚的樹脂。通過單因素試驗進一步優(yōu)化X-5樹脂對石榴花多酚的純化條件，所得最佳上樣條件為：上樣液濃度3.1 g/L，pH值 2.0，上樣液流速2 mL/min；最佳洗脫條件：洗脫液為70%乙醇溶液，洗脫流速為2 mL/min，洗脫體積為80 mL。

關(guān)鍵詞：大孔吸附樹脂；靜態(tài)吸附；解吸；純化；洗脫；石榴花；多酚

中圖分類號： R284.2 文獻標志碼： B 文章編號：1002-1302（2015）10-0359-03

石榴5—7月開花，花期長，開花量大，不能結(jié)實的鐘狀花和部分筒狀花會自然脫落，因此石榴花資源豐富，極具開發(fā)價值。石榴花中含有黃酮、多酚及三萜類等物質(zhì)[1-2]，其中含量最豐富的是多酚，Kaur等報道石榴花乙醇提取物中的多酚含量達321.8 mg/g（以沒食子酸為標準品）[3]。近年來，有大量研究表明，石榴花多酚不僅具有顯著的抗氧化活性[4]，還具有抑制低密度脂蛋白和膽固醇的氧化[5]，防止動脈粥樣硬化，降血壓，降血脂[1]，抑制乳腺癌、前列腺癌和口腔癌等癌細胞增生[6-7]，減輕對肝組織的氧化損傷[3]等功能。因此，石榴花多酚在食品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域有一定的應(yīng)用前景。石榴花提取物中多酚總量與其多種生物活性呈明顯的正相關(guān)性[4]，采用溶劑法提取的石榴花多酚還含有多種其他成分，因此需要對其進行純化，才能提高其利用效率。目前，可用于植物多酚純化的方法主要有溶劑萃取法[8]、重金屬沉淀法[9]和樹脂吸附法。萃取法須消耗大量三氯甲烷等有機溶劑，沉淀法須要消耗重金屬，這2種方法容易導(dǎo)致產(chǎn)品中有機溶劑或重金屬殘留，而且產(chǎn)品收率較低。大孔樹脂具有選擇性強、吸附速度快、容量大、解吸容易、成本低等優(yōu)點，近年來被用于分離純化植物中的多酚[10]、黃酮[11]、花青素[12]等天然產(chǎn)物。然而，目前在還未見有關(guān)大孔吸附樹脂法純化石榴花多酚的研究報道。本研究從5種國產(chǎn)大孔樹脂中篩選出 1種對石榴花多酚具有良好吸附和解吸性能的樹脂，考察了該樹脂對石榴花多酚的吸附與解吸性能及主要的影響因素，以期建立適宜的石榴花多酚純化條件，為石榴花的深加工提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

石榴花采自山東省棗莊市石榴園，于鼓風干燥箱內(nèi) 115 ℃ 殺青處理5 min，然后在80 ℃烘干至恒質(zhì)量，粉碎后過孔徑約380～400 μm篩，備用。經(jīng)預(yù)處理過的D101、AB-8、DA201、DM130和X-5大孔吸附樹脂由安徽三星樹脂科技有限公司提供。

1.2 儀器與試劑

UV-2550 紫外可見分光光度計（日本島津公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA（上海亞榮生化儀器廠），玻璃層析柱（1.5 cm×20 cm），KQ-5200超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）。沒食子酸標準品為Sigma公司產(chǎn)品，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 分析方法

多酚含量的測定采用Folin-Ciocalteu試劑比色法，以沒食子酸為標準品。

1.4 試驗方法

1.4.1 石榴花多酚提取液的制備方法 石榴花干燥粉碎，超聲波輔助提?。?0%乙醇溶液，料液比1 g ∶ 20 mL，超聲波功率80 W，溫度30 ℃，處理時間40 min），過濾，棄去濾渣，回收濾液即為石榴花多酚提取液的母液，并用Folin-Ciocalteu法測定濾液中的多酚含量，不同含量的提取液由母液稀釋配制。

1.4.2 樹脂靜態(tài)吸附與解吸試驗 分別稱取5種預(yù)處理過的大孔吸附樹脂D101、AB-8、DA201、DM130和X-5各 2 g，置于100 mL的錐形瓶中，并加入50 mL多酚含量為 2.5 g/L 的石榴花粗提物樣品液，在25 ℃恒溫環(huán)境中吸附 12 h，取其中一定量的樣品液用于測定其中的多酚含量；靜態(tài)吸附后過濾除去石榴花粗提物溶液，樹脂用蒸餾水洗凈，放入100 mL的錐形瓶中，加入50 mL無水乙醇，于相同溫度下解吸，取一定量解吸液測其中的多酚含量，以比較不同樹脂對石榴花多酚的吸附和解吸特性。吸附量、吸附率、解吸率、回收率的計算公式：吸附量（mg/g）=（ρ0-ρe）×V0/m；吸附率=（ρ0-ρe）/ρ0×100%；解吸率=ρd/（ρ0-ρe）×100%；回收率=ρd/ρ0×100%。其中：ρ0表示提取物溶液中多酚含量，g/L；ρe表示上清液中多酚的含量，g/L；ρd表示解吸液的多酚含量，g/L；V0表示提取物溶液體積，mL；Vd表示解吸液體積，mL；m表示樹脂質(zhì)量，g。

1.4.3 樹脂吸附條件的優(yōu)化

1.4.3.1 上柱液 pH 值對吸附效果的影響 將預(yù)處理好的X-5樹脂，裝入1.5 cm×20.0 cm的層析柱中，層析柱高度（L）/層析柱內(nèi)徑（D）=13。用水洗滌平衡后上柱，上柱條件：流速3 mL/min，上樣液中多酚含量2.5 g/L，上柱液體積V=160 mL，上柱液 pH 值分別為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0。檢測漏出液多酚含量，考察上柱液 pH 值對樹脂吸附石榴花多酚含量的影響。

1.4.3.2 上柱液濃度對吸附效果的影響 吸附條件：最佳 pH 值由“1.4.3.1”節(jié)確定，石榴花提取液中多酚含量經(jīng)稀釋分別調(diào)整為0.11、0.42、0.85、1.55、2.49、3.11、4.66、6.22 g/L，各50 mL，置于100 mL錐形瓶中，加入5 g預(yù)處理過的X-5大孔吸附樹脂，25 ℃水浴吸附12 h，檢測上清液多酚含量，計算X-5樹脂對多酚的吸附量，考察上樣液濃度對吸附量的影響，繪制靜態(tài)吸附曲線。

1.4.3.3 X-5樹脂的吸附動力學 按照“1.4.3.2”節(jié)確定的最佳濃度配制石榴花粗提物溶液50 mL，置于100 mL錐形瓶中，加入5 g預(yù)處理過的X-5大孔吸附樹脂，25 ℃水浴吸附，分別在吸附后1、2、3、4、5、6 h取上清液樣品2 mL，測定其多酚含量，繪制吸附動力學曲線。endprint

1.4.3.4 上樣液流速對吸附效果的影響 將多酚含量為31 mg/mL的石榴花提取液50 mL（pH值由“1.4.3.1”節(jié)確定）分別以6、4、2、1 mL/min的流速上柱，然后用去離子水沖洗至澄清，以70%乙醇作洗脫液，流速2 mL/min，測定洗脫液中多酚含量，計算樹脂對多酚的吸附量，然后以流速為橫坐標、吸附量為縱坐標繪制曲線。

1.4.4 樹脂洗脫條件的優(yōu)化

1.4.4.1 乙醇濃度對洗脫效果的影響 取100 mL多酚含量為3 mg/mL的石榴花提取液，加入25 g X-5樹脂，25 ℃下吸附12 h，濕法上柱，用去離子水沖洗，再分別用100 mL 20%、40%、60%、70%、80%的乙醇溶液洗脫，流速 6 mL/min，測定洗脫液中多酚含量，考察乙醇濃度對洗脫效果的影響。

1.4.4.2 洗脫液體積對洗脫效果的影響 依照“1.4.3”節(jié)優(yōu)化的吸附條件上柱吸附之后，用40 mL水迅速沖洗樹脂柱，洗脫條件：洗脫液由“1.4.4.1”節(jié)確定，流速為80 mL/h。洗脫液分步收集并測定其多酚含量，繪制動態(tài)解吸曲線，從而考察洗脫液體積影響洗脫液效果的情況。

1.4.4.3 洗脫流速對洗脫效果的影響 按“1.4.3”節(jié)優(yōu)化的吸附條件上柱吸附之后，用40 mL水快速淋洗樹脂柱，洗脫條件：洗脫液由“1.4.4.1”節(jié)確定，洗脫液體積由“1.4.4.2”節(jié)確定，洗脫流速分別為6、4、2、1 mL/min。收集洗脫液并測定其含量，考察洗脫流速對洗脫效果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹脂的的篩選

通過靜態(tài)吸附與解吸試驗測定5種大孔樹脂的吸附與解吸特性，結(jié)果見表1。其中，X-5型大孔吸附樹脂對石榴花多酚的吸附容量、吸附率、解吸率及回收率都是最高的。吸附量和解吸率是評價一種樹脂性能優(yōu)劣的主要參數(shù)，前者反映樹脂的吸附能力，后者反映吸附之后能否容易洗脫下來。 因此，X-5樹脂純化石榴花中的多酚較為理想。

2.2 X-5大孔吸附樹脂吸附條件的優(yōu)化

2.2.1 上樣液pH值對吸附效果的影響 由圖1 可知，其他操作條件不變，隨著pH 值的升高，樹脂對石榴花多酚的吸附量逐漸降低，說明低pH值有利于吸附。石榴花多酚含有鞣花酸、沒食子酸等酚酸類物質(zhì)[2]，因此具有弱酸性，在pH值較大時會解離成離子形態(tài)存在，此時不易被大孔樹脂吸附，而以分子態(tài)存在時易被所用的大孔樹脂吸附。當pH值下降時，石榴花多酚多以分子態(tài)存在就易被大孔樹脂吸附。因此，pH值為 2.0的條件最適合X-5樹脂吸附石榴花多酚。

2.2.2 上樣液濃度對吸附效果的影響 從圖2可以看出，上樣液濃度較低時，X-5樹脂對對石榴花多酚的吸附量隨上樣液濃度的增大而增大；在石榴花多酚含量為3.1 mg/mL時，吸附量達到最大；之后，吸附量反而隨上樣液濃度的增大而逐漸下降，這種變化趨勢與其他文獻中的結(jié)果[13-15]一致。上樣液的濃度決定了同一時間與樹脂相互作用的目標物質(zhì)分子數(shù)量，從理論上講，在達到飽和之前，該數(shù)量越大越有利于目標物質(zhì)的富集；超過一定值后，隨濃度增大，吸附量下降，可能是由于上樣液中的糖類等物質(zhì)在較大濃度時黏度變大，堵塞樹脂孔隙，目標物質(zhì)與樹脂相互作用的機會減少，從而影響對多酚的吸附量。因此，選擇3.1 mg/mL作為上樣液濃度。

2.2.3 吸附動力學曲線 吸附速度也是大孔樹脂吸附性能的重要參考指標。25 ℃時，X-5樹脂對石榴花多酚的靜態(tài)吸附動力學曲線見圖3。由圖3可以看出，在0～5 h內(nèi)，X-5樹脂對石榴花多酚的吸附量隨時間的延長而增大，之后趨于穩(wěn)定，說明吸附 5 h即可達到飽和，而XDA-1樹脂對杜仲黃酮的吸附需要10 h以上才能達到平衡[11]，可見X-5樹脂對石榴花多酚的吸附屬快速吸附平衡型。

2.2.4 上樣液流速對吸附效果的影響 由圖4可見，隨上柱流速的增大，對石榴花多酚的吸附量逐漸減小。流速對樹脂吸附的影響主要是影響溶質(zhì)向樹脂表面擴散，從而對吸附效果產(chǎn)生影響。上柱時流速過大，石榴花多酚溶液與樹脂之間接觸時間變短，石榴花多酚分子來不及進入到樹脂的內(nèi)表面而流過，從而降低吸附率。降低流速，會使石榴花多酚分子同樹脂的內(nèi)表面有足夠的接觸時間，有利于樹脂吸附石榴花多酚，減少多酚的漏出量，從而提高其吸附率；當流速過小時，會使作業(yè)周期延長，提高成本。從本試驗結(jié)果來看，上柱流速為1 mL/min的吸附量與上柱流速為2 mL/min的吸附量相差不大，因此上柱流速以 2 mL/min 為宜。

2.3 X-5樹脂對多酚吸附后洗脫條件的優(yōu)化

2.3.1 洗脫液濃度的選擇 為盡可能提高多酚的回收率，通常選用解吸率較高的溶劑作為解吸劑，丙酮、甲醇及乙醇是常用的解吸劑，但考慮到石榴花多酚要應(yīng)用在食品及化妝品中，因此本試驗選用無毒性的乙醇作為解吸劑，并考察乙醇濃度對解吸效果的影響，結(jié)果如圖5所示。當乙醇濃度為20%～60%時，解吸效果很低，變化也不大；超過60%之后，隨乙醇濃度增大，解吸效果迅速提高，當乙醇濃度為70%時，解吸效果最好，之后又迅速下降。因此，宜選用70%乙醇溶液對石榴花多酚進行洗脫。

2.3.2 洗脫液體積對解吸效果的影響 經(jīng)吸附達到飽和的X-5樹脂先用40 mL的水洗去樹脂吸附的可溶性糖類，再用200 mL的70%乙醇溶液洗脫，洗脫速度為2 mL/min，在室溫下測定乙醇溶液對多酚物質(zhì)的動態(tài)洗脫效果，結(jié)果如圖6所示。圖6顯示，在動態(tài)條件下極易洗脫X-5樹脂上吸附的多酚物質(zhì)，很少量的洗脫液即可達到洗脫效果。多酚物質(zhì)的洗脫高峰也相對比較集中，當洗脫液體積為10～40 mL時，洗脫液中的石榴花多酚含量較高；在洗脫液體積達到80 mL時，能夠?qū)⑽皆赬-5樹脂上的多酚充分洗脫，因此，洗脫液體積宜選擇80 mL。

2.3.3 洗脫液流速對解吸效果的影響 圖7顯示，流速越大，洗脫效果越差，其中流速為1 mL/min 的解吸效果是流速為4 mL/min的3倍。因流速加快，洗脫液未能與被吸附的多酚進行充分作用而將其從大孔樹脂的吸附位點上置換出來；而流速太小會使作業(yè)周期延長。因此，在本研究條件下，70%乙醇洗脫流速宜控制在2 mL/min。endprint

3 結(jié)論

X-5樹脂用于石榴花多酚純化具有吸附量大、吸附率高、易解吸等特點，是純化石榴花多酚的理想材料。選用X-5大孔吸附樹脂純化石榴花多酚的最佳上樣條件為：上樣液濃度3.1 g/L，pH 值2.0， 上樣液流速 2 mL/min； 最佳洗脫條件：洗

脫液為70%乙醇溶液，流速2 mL/min，洗脫液體積為 80 mL。

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