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    大薯組培苗抗炭疽病接種方法的比較

    2015-12-23 12:08吳文嬙韋永選周鑫黃小龍?jiān)S云黃東益
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年10期
    關(guān)鍵詞:炭疽病

    吳文嬙+韋永選+周鑫+黃小龍+許云+黃東益

    摘要:炭疽病是大薯生產(chǎn)上最嚴(yán)重的病害,迫切需要可靠的方法來(lái)篩選抗病種質(zhì)。采用薯蕷上分離到的2份炭疽病菌株SY01、DJ01的分生孢子對(duì)大薯Da87、Da115的組培苗進(jìn)行接種,通過(guò)對(duì)病情指數(shù)的比較分析最佳的接種方法。結(jié)果表明:大薯Da87、Da115對(duì)炭疽菌的抗性差異極顯著,菌株SY01、DJ01之間致病力差異極顯著;在篩選的接種方法中,最佳的為使用3×106個(gè)/mL孢子濃度的涂抹法。

    關(guān)鍵詞:大薯;炭疽病;接種方法;病情指數(shù);抗病評(píng)價(jià)

    中圖分類(lèi)號(hào):S436.32 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1002-1302(2015)10-0174-02

    薯蕷家族廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū),大薯被公認(rèn)為是薯蕷中分布最廣、最多的種[1]。大薯(Dioscorea alata)別稱(chēng)參薯、腳板薯、菜山藥,為薯蕷屬單子葉藤本植物,在我國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)均有種植,是四大薯類(lèi)作物中營(yíng)養(yǎng)最豐富的作物,在非洲一些國(guó)家是僅次于木薯的主糧。

    炭疽病發(fā)病可從苗期開(kāi)始一直到采收,嚴(yán)重影響大薯的生長(zhǎng)及薯塊的產(chǎn)量。來(lái)自加勒比、南太平洋、西非和印度等國(guó)家和地區(qū)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,該病嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致產(chǎn)量下降90%,幾種常見(jiàn)的栽培種都缺乏抗性[2-3]。炭疽病(膠孢炭疽菌)引起葉片壞疽并且藤蔓枯萎,導(dǎo)致光合作用表面積的下降并且伴隨著薯蕷塊莖產(chǎn)量的下降。在塊莖形成前或者是形成期間病害的流行對(duì)塊莖產(chǎn)量的影響是極大的。炭疽病可發(fā)生在全株,包括葉片、藤蔓、薯塊,帶病的種薯、土壤會(huì)持續(xù)影響,甚至導(dǎo)致絕種[4]。在我國(guó)南方地區(qū),高溫多雨的天氣更有利于大薯炭疽病的發(fā)生和發(fā)展。在法國(guó)西部和尼日利亞侵染薯蕷類(lèi)作物的炭疽病病原菌表現(xiàn)出遺傳性和致病性的明顯差異[5-8]。國(guó)內(nèi)外大多采用離體葉片進(jìn)行抗性鑒定,筆者經(jīng)過(guò)多年研究發(fā)現(xiàn)該法并未能完全反映種質(zhì)的抗性水平且重復(fù)性比較差。由于大薯在種植時(shí)主要采用薯塊育苗,進(jìn)行苗期抗性鑒定需要大量的薯塊,且生產(chǎn)周期上無(wú)法滿(mǎn)足準(zhǔn)確可靠的抗病性鑒定的試驗(yàn)要求。用組培苗進(jìn)行大量基因型的快速篩選對(duì)于膠孢炭疽菌的毒力和侵染力的分析是精確有用的[9],組培苗還可用于栽培種-分離物互作的研究和研究侵染進(jìn)程[10-11]。更進(jìn)一步,組培苗可用于評(píng)價(jià)栽培種對(duì)特定分離物的反應(yīng)。這些對(duì)于非當(dāng)?shù)氐哪z孢炭疽菌的篩選和國(guó)家交流項(xiàng)目的薯蕷評(píng)價(jià)是可行的[12]。因此,本研究欲采用已分離鑒定的炭疽病菌對(duì)大薯組培苗進(jìn)行抗性鑒定,篩選最佳的接種方法。目前,筆者所在課題組已經(jīng)收集了我國(guó)南方地區(qū)160份的大薯種質(zhì)資源,建立了我國(guó)的薯蕷種質(zhì)資源圃,分離鑒定了100株來(lái)自薯蕷的炭疽病菌株,建立快速有效的苗期抗性鑒定方法對(duì)于我國(guó)大薯抗性種質(zhì)資源的篩選十分必要。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    供試菌株:DJ01(分離自海南儋州大薯)、SY01(分離自海南海口山藥);供試大薯:Da87、Da115;盆栽基質(zhì):營(yíng)養(yǎng)土 ∶ 陶粒 ∶ 草木灰=3 ∶ 1 ∶ 1。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 大薯組培苗的獲得 以幼嫩的大薯實(shí)生苗的單個(gè)帶節(jié)莖段為外植體,經(jīng)自來(lái)水沖洗30 min,用75%乙醇浸泡15 s,選用0.1%HgCl2處理8~10 min,再用無(wú)菌水洗3~5次。將消毒好的帶芽莖段接種到培養(yǎng)基(MS+3%蔗糖+03%植物凝膠,pH值5.8)中。無(wú)菌苗培養(yǎng)2個(gè)月,選擇長(zhǎng)出5~8張葉且已生根的材料進(jìn)行煉苗。煉苗1周后移栽至營(yíng)養(yǎng)缽,待植株葉片開(kāi)始恢復(fù)生長(zhǎng)后進(jìn)行接種。

    1.2.2 接種菌孢子的制備 先將菌種接在PDA 平板上進(jìn)行活化,在28 ℃下培養(yǎng)7 d,經(jīng)過(guò)過(guò)濾純化后收集孢子配置懸浮液。采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法將供試菌株的孢子懸浮液分別配制成3個(gè)濃度:3×105、 3×106、3×107個(gè)/mL。

    1.2.3 接種方法 接種采用噴霧法、多針接種法、涂抹法進(jìn)行試驗(yàn)。采用2種菌株接種2種大薯種質(zhì),分別用上述3種濃度處理,每個(gè)處理10株苗,設(shè)置3株接種水作為對(duì)照,試驗(yàn)重復(fù)3次。接種時(shí)室溫為(26±2) ℃,用塑料薄膜覆蓋,黑暗保濕2 d,之后揭開(kāi)覆蓋,自然光照下培育。接種12 d后開(kāi)始調(diào)查發(fā)病情況及統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)。

    1.2.4 病葉分級(jí) 大薯炭疽病室內(nèi)苗期抗病性調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):0級(jí),無(wú)癥狀;1級(jí),病斑直徑0~1.0 mm,有1~2張葉發(fā)病;2級(jí),病斑直徑在11~20 mm,有2張真葉發(fā)病,或有少數(shù)大斑;3級(jí),病斑直徑在21~30 mm,并產(chǎn)生孢子,或有2張以上葉片發(fā)病,病株出現(xiàn)落葉,株形不正常;4級(jí),有許多大斑,大量產(chǎn)生孢子,病株大量落葉,近枯死或枯死。

    (1)病情指數(shù)。將參試品種的發(fā)病級(jí)別按病情指數(shù)計(jì)算式換算成該種質(zhì)的病情指數(shù),換算公式如下:病情指數(shù)(DI)=∑(株數(shù)×病級(jí)數(shù))/(總株數(shù)×最高病級(jí)數(shù))×100。

    (2)抗病性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。薯蕷種質(zhì)炭疽病抗性鑒定分為6個(gè)等級(jí)[13]:1級(jí),免疫(immune,I),DI=0;2級(jí),高抗(highly resistant,HR),080。

    1.2.5 菌株致病性分級(jí) 菌株致病性類(lèi)型劃分標(biāo)準(zhǔn)如下[14]:強(qiáng)(A):平均病情指數(shù)40.1~ 100.0;中(B):平均病情指數(shù) 20.1~ 40.0;弱(C):平均病情指數(shù)0.1~20.0;無(wú)致病力(D):平均病情指數(shù)為0。

    1.2.6 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)采用SAS軟件進(jìn)行Duncanss測(cè)驗(yàn)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 大薯種質(zhì)的炭疽病抗性鑒定

    不同處理下大薯種質(zhì)的病情指數(shù)均值(表1)表明:大薯種質(zhì)Da115、Da87對(duì)炭疽病的抗性為中感(MS),Da115、Da87的病情指數(shù)差異極顯著,Da115較Da87更易感病。

    2.2 薯蕷炭疽菌菌株的致病力檢測(cè)

    由表2不同處理下薯蕷炭疽菌菌株致病后引起的病情指數(shù)均值表明:薯蕷炭疽菌菌株DJ01、SY01的致病性為中致病性,二者的致病力差異極顯著,菌株DJ01的致病力較強(qiáng)。

    2.3 不同接種菌液孢子濃度和不同接種方法對(duì)大薯炭疽病發(fā)病情況的影響

    表3的2份炭疽菌菌株的3種孢子濃度接種2份大薯種質(zhì)后的病情指數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明:多針接種法和涂抹法的不同孢子濃度接種后病情指數(shù)差異均達(dá)到了極顯著水平;噴霧法的孢子濃度水平為 3×105、3×106個(gè)/mL之間差異未達(dá)到極顯著水平。當(dāng)孢子濃度水平為3×105個(gè)/mL時(shí),涂抹法和噴霧法的病情指數(shù)較低,且差異不顯著,未達(dá)到大薯種質(zhì)病情指數(shù)的均值,不適于進(jìn)行抗病性鑒定。當(dāng)孢子濃度水平為3×106、3×107個(gè)/mL時(shí),3種接種方法的病情指數(shù)差異均達(dá)到了極顯著水平。綜合來(lái)看,多針接種法發(fā)病早,病情指數(shù)均高于2份大薯種質(zhì)的平均病情指數(shù)和2份炭疽菌菌株的平均致病力,當(dāng)孢子濃度水平為3×107個(gè)/mL時(shí)病情指數(shù)均值高達(dá)90.26,接近死亡,因此多針接種法不適合用于大薯種質(zhì)的抗病性鑒定。噴霧法總體的病情指數(shù)較低,需要較高的孢子濃度才能達(dá)到適合的病情指數(shù)。當(dāng)孢子濃度為3×106個(gè)/mL時(shí),涂抹法的病情指數(shù)與大薯種質(zhì)的平均病情指數(shù)和炭疽菌平均致病力較一致。因此最佳的接種方法為涂抹法,孢子濃度水平為3×106個(gè)/mL。

    3 結(jié)論與討論

    目前,活體接種的結(jié)果能較充分地反映植株對(duì)病原菌的抗性,室內(nèi)接種鑒定方法的研究能為抗性種質(zhì)篩選提供可靠的依據(jù)。Onyeka等用3份大薯炭疽菌分離物(膠孢炭疽菌)來(lái)評(píng)價(jià)60份大薯栽培種的組培苗反應(yīng),認(rèn)為組培苗提供了用于評(píng)價(jià)大量大薯種質(zhì)的快速、可靠和健全的方法,可進(jìn)一步用于田間的測(cè)試,這項(xiàng)技術(shù)降低了大量株系所需要的大面積土地[12]。Akem用噴霧法接種大薯抗病種質(zhì)Dan087、TDa86/00620、TDa316以及感病種質(zhì)TDa85/00257、TDa86/00607、TDa85/00250進(jìn)行致病性試驗(yàn),每個(gè)植株用2mL孢子濃度為1.6×106個(gè)/mL的孢子懸浮液噴霧接種,28 d后觀察并記錄植株的感病情況[15]。炭疽病菌孢子雖然是接種在活體植株上,但是發(fā)病周期較長(zhǎng)。陳吉良采用大薯和山藥的離體葉片進(jìn)行菌株致病性鑒定和植株的抗性初篩,初篩結(jié)果往往與田間的抗性鑒定不一致,這可能與田間環(huán)境有較大差異相關(guān),也可能是離體葉片與活體植株的差異導(dǎo)致的[16]。本試驗(yàn)中對(duì)于同一份材料的抗病等級(jí)是基于不同處理下病情指數(shù)的均值,在3種接種方法中基于這個(gè)均值進(jìn)行衡量,多針接種法發(fā)病快、發(fā)病較嚴(yán)重,但是較難比較種質(zhì)之間的抗性差異;噴霧法發(fā)病較慢,需要較多的孢子進(jìn)行侵染;相比之下,涂抹法較適中。在3種孢子濃度侵染時(shí),孢子濃度為3×105個(gè)/mL時(shí),僅在多針接種法中表現(xiàn)出較高的病情指數(shù),而在涂抹法和噴霧法中均表現(xiàn)為較低的病情指數(shù);濃度為3×106個(gè)/mL時(shí),多針接種法有較高的病情指數(shù),而噴霧法有較低的病情指數(shù),涂抹法較適宜;濃度為3×107個(gè)/mL時(shí),多針接種法接種的植株接近死亡,適宜用涂抹法和噴霧法。因此,本研究表明,當(dāng)孢子濃度水平為3×106個(gè)/mL時(shí),涂抹法最適宜大薯組培苗的抗病性鑒定。

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