大鼠雙后肢擠壓傷后肺、肝細(xì)胞的凋亡

趙杰，王華榮，步建衡，左敏，張國(guó)忠

（1.河北省公安廳物證鑒定中心，河北石家莊 050000；2.滄州市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，河北滄州 061000；3.河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系，河北石家莊 050051）

大鼠雙后肢擠壓傷后肺、肝細(xì)胞的凋亡

趙杰1，王華榮2，步建衡1，左敏3，張國(guó)忠3

（1.河北省公安廳物證鑒定中心，河北石家莊 050000；2.滄州市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，河北滄州 061000；3.河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系，河北石家莊 050051）

目的研究大鼠雙后肢擠壓傷后肺、肝細(xì)胞的凋亡過(guò)程，探討擠壓傷損傷機(jī)制。方法建立大鼠雙后肢擠壓傷模型，采用TUNEL法對(duì)大鼠肺、肝細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組相比，損傷組大鼠雙后肢局部肌肉組織明顯損傷，肺、肝細(xì)胞凋亡明顯增多（P〈0.05），凋亡相關(guān)蛋白Bax上調(diào)、Bcl-2下調(diào)、caspase-3被激活（P〈0.05）。結(jié)論大鼠雙后肢擠壓傷后引起肺、肝細(xì)胞凋亡明顯增多，可能是損傷釋放的相關(guān)因子介導(dǎo)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

法醫(yī)病理學(xué)；創(chuàng)傷和損傷；擠壓；細(xì)胞凋亡；Bax；Bcl-2；caspase-3；大鼠

廣泛軟組織損傷在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中較為常見(jiàn)，多見(jiàn)于打架斗毆、刑訊逼供、虐待等，也可見(jiàn)于交通事故、地震和工礦塌方等意外事故。一般損傷集中于臀部、雙下肢以及背部等肌肉軟組織豐富的部位，其損傷特點(diǎn)是局部損傷貌似輕微，全身性繼發(fā)性病理變化隱匿，后果嚴(yán)重，可引起器官的嚴(yán)重?fù)p害，直至創(chuàng)傷性多器官功能衰竭（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）。MODS是創(chuàng)傷患者嚴(yán)重并發(fā)癥之一，病情進(jìn)展快，死亡率高。在MODS的發(fā)病過(guò)程中，不僅是缺血-再灌注，過(guò)度炎癥及內(nèi)毒素攻擊能直接引起細(xì)胞受損——“他殺”而死，同時(shí)也有基因調(diào)控的“自殺”而死，即細(xì)胞凋亡的過(guò)程[1]。嚴(yán)重創(chuàng)傷后，機(jī)體內(nèi)各器官中普遍發(fā)生了細(xì)胞凋亡，而且這種凋亡往往發(fā)生的時(shí)間很早，而壞死則主要在后期發(fā)生；也就是說(shuō)，細(xì)胞凋亡不僅參與了MODS，而且還可能在MODS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要的角色。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠雙后肢擠壓傷模型，用原位末端標(biāo)記（TUNEL）法和免疫組織化學(xué)法分別檢測(cè)肺和肝細(xì)胞凋亡變化以及Bax、Bcl-2、caspase-3凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，探討擠壓傷損傷機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

TUNEL試劑盒（德國(guó)寶靈曼公司），兔抗鼠Bax多克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體（丹麥Dako公司），caspase-3試劑盒（美國(guó)Zymed公司），其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 模型建立

健康Wistar大鼠40只，體質(zhì)量（160±20）g，雌雄不限，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為損傷組和對(duì)照組，每組20只。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食12h，自由飲水。損傷組大鼠用45mg/kg 5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，俯臥位固定于鼠臺(tái)上，于雙后肢上壓15kg標(biāo)準(zhǔn)重物，持續(xù)擠壓5h，然后解除擠壓，使其自由活動(dòng)，繼續(xù)觀察5h。對(duì)照組大鼠除不擠壓外，其余處理與損傷組相同。

1.3 取材及處理

將大鼠用5%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）麻醉后，沿腹中線分層切開(kāi)腹壁，大鼠經(jīng)腹主動(dòng)脈快速放血處死，提取受壓肢體肌肉組織、肺及肝組織適量，用10%中性甲醛溶液固定。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 病理學(xué)觀察

觀察受壓肢體的大體病理學(xué)變化，并取受壓肢體肌肉組織、部分肺組織和肝組織常規(guī)制作石蠟切片、HE染色，顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.4.2 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

參照試劑盒操作指南進(jìn)行。石蠟切片厚5μm，脫蠟至水，蒸餾水洗，磷酸緩沖液（PBST）洗3次，2%蛋白酶K 37℃，孵育30min，雙蒸水（DDW）洗3次，孵育3 min，DDW洗3次，3%H2O2孵育10 min，DDW 洗3次，加標(biāo)記緩沖液，室溫放15min，加入等量的用標(biāo)記緩沖液配制的TdT和Bio-dUTP，37℃孵育1 h，將標(biāo)本在2×SSC中浸泡15min（室溫），PBST洗3次，加封閉液，室溫封閉30 min，加入用封閉液稀釋?zhuān)?∶50）的Avidin-HRP，37℃孵育1h，DAB顯色，常規(guī)復(fù)染，封片，顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞核呈棕黃色凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并拍照。TUNEL法計(jì)算細(xì)胞凋亡率：每組觀察4張切片，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，以百分?jǐn)?shù)表示凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）。

1.4.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

采用免疫組織化學(xué)法（SP法）檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3的表達(dá)。石蠟切片梯度乙醇脫蠟至水，Bax、Bcl-2、caspase-3一抗稀釋比分別為1∶50、1∶100、1∶100。

分析Bax、Bcl-2、caspase-3表達(dá)的免疫組織化學(xué)圖像，固定電壓，固定入射光強(qiáng)度，HPIAS-1000高清晰度彩色病理系統(tǒng)（南京紅綠藍(lán)智能系統(tǒng)有限公司）隨機(jī)選取4個(gè)視野，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，測(cè)量各組陽(yáng)性細(xì)胞的光密度值，取均值后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。

1.4.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間差異用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)觀察結(jié)果

損傷組大鼠被切開(kāi)雙后肢肌肉組織時(shí)可見(jiàn)多量粉紅色液體從切面溢出，鏡下觀察肌纖維明顯腫脹，橫紋不清，部分肌纖維溶解，小血管明顯淤血，間質(zhì)出血、水腫。對(duì)照組肌纖維結(jié)構(gòu)清楚，未見(jiàn)明顯異常改變。

損傷組大鼠肺、肝組織呈輕度充血表現(xiàn)，血管內(nèi)中性白細(xì)胞聚集，間質(zhì)水腫、出血，彌散性血管內(nèi)凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）形成，實(shí)質(zhì)細(xì)胞顆粒變性，肺組織可見(jiàn)散在核固縮細(xì)胞，肝小葉中央帶核固縮細(xì)胞增多。對(duì)照組未見(jiàn)明顯異常改變。

2.2 肺、肝細(xì)胞凋亡

凋亡細(xì)胞在肺組織主要分布于支氣管黏膜和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，在肝組織主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞（圖1），對(duì)照組AI明顯低于損傷組（表1，P〈0.05）。

表1 兩組大鼠肺、肝細(xì)胞AI比較（n=20，±s，%）

表1 兩組大鼠肺、肝細(xì)胞AI比較（n=20，±s，%）

組別肺肝對(duì)照4.40±0.154.22±0.37損傷13.19±0.161）14.31±0.161）

2.3 肺、肝細(xì)胞Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白的表達(dá)

損傷組Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)在肺組織主要分布于肺支氣管黏膜和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，在肝組織主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞（圖2）。對(duì)照組陽(yáng)性表達(dá)低于損傷組（表2，P〈0.05）。

圖2 大鼠肺、肝Bax免疫組織化學(xué)染色SP×100

表2 大鼠肺、肝細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的光密度值（n=20，±s）

表2 大鼠肺、肝細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的光密度值（n=20，±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P〈0.05

蛋白組別肺肝Bax對(duì)照1.69±0.400.56±0.08損傷3.64±0.211）3.18±0.251）Bcl-2對(duì)照4.68±0.384.77±0.25損傷2.64±0.281）2.27±0.291）caspase-3對(duì)照2.31±0.082.25±0.11損傷4.47±0.171）4.49±0.171）

損傷組Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)在肺組織主要分布于支氣管黏膜、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，在肝組織主要分布于微血管及血管內(nèi)皮細(xì)胞（圖3）。對(duì)照組陽(yáng)性表達(dá)高于損傷組（表2，P〈0.05）。

損傷組caspase-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)在肺組織主要分布于支氣管黏膜、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，在肝組織主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞（圖4）。對(duì)照組陽(yáng)性表達(dá)低于損傷組（表2，P〈0.05）。

圖3 大鼠肺、肝Bcl-2免疫組織化學(xué)染色SP×100

圖4 大鼠肺、肝caspase-3免疫組織化學(xué)染色SP×100

3 討論

傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為，在嚴(yán)重?fù)p傷和休克等急性損傷時(shí)，機(jī)體組織、細(xì)胞因缺血、缺氧等引發(fā)壞死。近年來(lái)，隨著對(duì)細(xì)胞凋亡認(rèn)識(shí)的深入，許多學(xué)者注意到細(xì)胞凋亡與MODS的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，在嚴(yán)重創(chuàng)傷后，機(jī)體內(nèi)各器官中普遍發(fā)生了細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡不僅參與了MODS，而且在其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要的角色[2]。陸江陽(yáng)等[3]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察到MODS早期免疫器官細(xì)胞凋亡增多的現(xiàn)象。

3.1 大鼠雙后肢擠壓傷模型的建立

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)應(yīng)用相當(dāng)于大鼠體質(zhì)量約100倍的重物擠壓大鼠雙后肢導(dǎo)致受壓局部肌肉嚴(yán)重?fù)p傷。持續(xù)擠壓5h，然后解除擠壓、釋放大鼠，使其自由活動(dòng)，又連續(xù)觀察了5h后處死大鼠，這為觀察擠壓傷后早期肌肉組織損傷提供了充足的時(shí)間[4]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠肢體擠壓解除后逐漸腫脹、青紫，肌纖維溶解，血管擴(kuò)張、淤血、出血、間質(zhì)水腫等繼發(fā)性損傷。表明擠壓大鼠雙后肢不僅導(dǎo)致受壓局部肌肉損傷，還造成了更嚴(yán)重的繼發(fā)性損傷。

3.2 擠壓傷導(dǎo)致肺和肝細(xì)胞凋亡的增多

本實(shí)驗(yàn)采用TUNEL法，檢測(cè)到損傷組大鼠肺、肝等遠(yuǎn)隔器官的AI明顯高于對(duì)照組，肺組織細(xì)胞凋亡主要分布在肺部支氣管黏膜和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，肝細(xì)胞凋亡主要分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞。結(jié)果說(shuō)明，大鼠雙下肢受到擠壓后引起遠(yuǎn)隔器官肺和肝凋亡細(xì)胞的增多，提示擠壓作為一個(gè)體外因素觸發(fā)了凋亡程序而引起了遠(yuǎn)隔器官肺和肝細(xì)胞凋亡的增加。

3.3 凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和caspase-3參與了細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是一個(gè)程序化的過(guò)程，是級(jí)聯(lián)式基因表達(dá)的結(jié)果，能影響細(xì)胞凋亡的因素很多，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)因素作用后，經(jīng)有關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)傳遞而激活凋亡相關(guān)基因，細(xì)胞即執(zhí)行死亡程序一步步走向死亡。在與細(xì)胞凋亡相關(guān)的眾多基因中，Bcl-2是第一個(gè)被確定的抑制細(xì)胞凋亡的基因，Bcl-2可以通過(guò)抑制促凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bax的細(xì)胞毒作用而阻抑多種凋亡誘導(dǎo)因素所引發(fā)的細(xì)胞凋亡[5]。caspase-3被認(rèn)為是在多種誘導(dǎo)劑刺激后導(dǎo)致蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵酶，其活化預(yù)示著細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段的開(kāi)始。Bcl-2也可以通過(guò)抑制caspase-3的激活而發(fā)揮其抗細(xì)胞凋亡作用[6]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)用免疫組織化學(xué)圖像分析方法觀察了Bax、Bcl-2和caspase-3表達(dá)的變化，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)在肺部主要分布于支氣管黏膜和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，損傷組陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組，在肝主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞。而B(niǎo)cl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)在肺部也主要分布于支氣管黏膜和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，損傷組陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組，在肝主要分布于微血管及血管內(nèi)皮細(xì)胞，Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)情況在肺部相同。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，擠壓傷后肺及肝細(xì)胞的caspase-3表達(dá)明顯高于對(duì)照組。損傷組遠(yuǎn)隔器官肺、肝細(xì)胞Bax的上調(diào)、Bcl-2的下調(diào)以及caspase-3被激活，說(shuō)明隨著擠壓的持續(xù)作用，肺、肝細(xì)胞的凋亡在加重，caspase-3參與介導(dǎo)了遠(yuǎn)隔器官肺、肝的細(xì)胞凋亡。

3.4 擠壓傷導(dǎo)致遠(yuǎn)隔器官細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)理

MODS的常見(jiàn)原因有創(chuàng)傷、感染、中毒等，Nuytinck 等[7]提出了創(chuàng)傷致MODS發(fā)生的全身炎癥介質(zhì)作用機(jī)理。本實(shí)驗(yàn)可能是在擠壓大鼠雙下肢后，局部創(chuàng)傷組織釋放出壞死分解產(chǎn)物等成分，激活效應(yīng)細(xì)胞釋放大量炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致遠(yuǎn)隔器官損傷。遠(yuǎn)隔器官細(xì)胞凋亡的發(fā)生可能與組織缺血缺氧、再灌注過(guò)程中氧自由基的作用，以及TNF、NO等炎癥介質(zhì)有關(guān)[8-9]。本研究證實(shí)，上述有害因子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)理可能與p53介導(dǎo)的Bax上調(diào)和Bcl-2下調(diào)途徑以及caspase-3的激活有關(guān)。

綜上所述，擠壓大鼠雙后肢可以引起遠(yuǎn)隔器官肺、肝細(xì)胞的凋亡，凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和caspase-3的表達(dá)參與了細(xì)胞凋亡的過(guò)程。至于擠壓大鼠雙后肢引起遠(yuǎn)隔器官肺、肝細(xì)胞凋亡的過(guò)程是由哪些蛋白和（或）因子介導(dǎo)的，還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

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Apoptosis in Lungs and Liver after Crush Injury of Hindlimbs in Rat

ZHAO Jie1,WANG Hua-rong2,BU Jian-heng1,ZUO Min3,ZHANG Guo-zhong3
（1.Center of Evidence Identification,Public Security Department of Hebei Province,Shijiazhuang 050000, China;2.Criminal Investigation Team,Cangzhou Public Security Bureau,Cangzhou 061000,China;3.School of Forensic Medicine,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050051,China）

Objective To investigate the process of apoptosis in lungs and liver induced by crushing hindlimbs of rat,and study the mechanism of crush injury.Methods The rat experimental model of hindlimbs crush injury was established.The cell apoptosis in lungs and liver was detected by TUNEL assay,and the expression of Bax,Bcl-2 and caspase-3 apoptin was examined by immunohistochemistry. Results Compared with the control group,the partial muscle injury of rat's hindlimbs was more serious with more apoptosis observed in lungs and liver（P＜0.05）.The expression of Bax was up-regulated and Bcl-2 was down-regulated,whereas caspase-3 expression was activated（P＜0.05）.Conclusion The cell apoptosis has increased significantly in lungs and liver after crush injury of hindlimbs in rat.The correlation factor released during tissue injury may mediate apoptosis process.

forensic pathology;wounds and injuries;crush;apoptosis;Bax;Bcl-2;caspase-3;rats

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2015.02.003

1004-5619（2015）02-0088-05

2013-11-07）

（本文編輯：張建華）

趙杰（1983—），男，山西介休人，碩士，主要從事法

醫(yī)病理學(xué)工作和研究；E-mail：zhaojie142433＠sina.com