Chelex-100法和QIAcube純化法在接觸性檢材檢驗中的比較

廖長青，成靜，劉維

（湘潭市公安局刑科所，湖南湘潭 411100）

Chelex-100法和QIAcube純化法在接觸性檢材檢驗中的比較

廖長青，成靜，劉維

（湘潭市公安局刑科所，湖南湘潭 411100）

法醫(yī)遺傳學(xué)；Chelex-100法；QIAcube純化法

在法醫(yī)DNA檢驗中，能否提取到足夠濃度與純度的DNA模板，是決定DNA檢驗成敗的關(guān)鍵之一。本研究分別采用Chelex-100法與QIAamp DNA Investigator試劑盒結(jié)合QIAcube核酸自動化提取儀（QIAcube純化法）提取實際檢案中的DNA，同等條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增與電泳，比較分析二者的圖譜，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

65份接觸性生物檢材來自本實驗室日常檢案積累，其中瓶口32份，工具手柄18份，繩索衣物類15份。瓶口和工具手柄檢材均采用生物物證提取專用棉簽（公安部物證鑒定中心）干濕兩步法提??；繩索衣物類檢材采用脫落細(xì)胞粘取器（公安部物證鑒定中心）粘附提取。

1.2 DNA提取

1.2.1 Chelex-100法

取檢材適量，剪碎后放入0.5mL離心管中，加入適量Chelex-100懸濁液與蛋白酶K溶液，恒溫?fù)u勻孵育儀（珠海博邁杰公司）上56℃孵育1.5h，煮沸10min，離心取上清液適量擴(kuò)增。

1.2.2 QIAcube純化法

取檢材適量，剪碎后放入0.5mL離心管中，加入QIAamp DNA Investigator試劑盒（德國QIAGEN公司）中ATL裂解液300μL及蛋白酶K 20μL，恒溫?fù)u勻孵育儀上56℃孵育1.5 h，再使用試劑盒提供的MinElute離心柱在QIAcube核酸自動化提取儀（德國QIAGEN公司）上純化提取DNA，洗脫體積30μL，取洗脫液適量擴(kuò)增。

1.3 PCR擴(kuò)增與STR分型

使用AmpFLSTR?Identifiler?Plus試劑盒（美國AB公司）在9700型PCR擴(kuò)增儀（美國AB公司）上擴(kuò)增，反應(yīng)體系10 μL，循環(huán)30次。擴(kuò)增產(chǎn)物在3130XL遺傳分析儀（美國AB公司）上電泳檢測，使用GeneMapper ID v3.2.1分析數(shù)據(jù)，圖譜峰高識別閾值為50RFU。

2 結(jié)果

對上述檢驗圖譜進(jìn)行統(tǒng)計，可以看出兩種提取方法的提取產(chǎn)物經(jīng)同樣的擴(kuò)增、檢測，QIAcube純化法所得結(jié)果要明顯優(yōu)于普通的Chelex-100法。按等位基因檢出數(shù)的不同，統(tǒng)計結(jié)果見表1。

表1 兩種提取方法的STR分型結(jié)果（等位基因檢出數(shù)）［例（%）］

瓶口檢材無論采用Chelex-100法還是QIAcube純化法均有較高的檢出率，尤其是使用QIAcube純化法時有90.63%的檢材可檢出9個以上等位基因，且峰高基本在1000RFU以上，多為單一來源，僅有2例混合斑。未檢出的3例均無瓶蓋保護(hù)，推測DNA降解毀損嚴(yán)重。

工具手柄擦拭子與繩索衣物類檢材使用Chelex-100法提取，檢出率均不高，尤其是繩索衣物類檢材使用脫落細(xì)胞粘取器粘取后直接用Chelex-100法提取時僅13.33%的檢材可檢出9個以上等位基因。使用QIAcube純化法提取，兩者的檢出率均有明顯提高，但峰高基本在2000RFU以下，而且來源復(fù)雜，多檢出混合基因圖譜。

3 討論

Chelex-100是一種由苯乙烯和二乙烯基苯共聚體組成的化學(xué)螯合樹脂，可以螯合多價金屬離子，尤其是選擇性螯合二價離子（如鎂離子），使體系中降解DNA的核酸酶失活，從而保護(hù)DNA分子。Chelex-100法提取DNA，在同一管中操作，因此檢材的損失率低，相對不容易污染，操作簡便快速，價格低廉，對試劑設(shè)備的要求低，廣泛適用于常規(guī)物證的DNA提取[1]。楊電等[2]用小體積Chelex-100法提取微量口腔脫落細(xì)胞檢材DNA進(jìn)行STR分型，9個以上STR位點分型成功率在60%左右，與筆者使用Chelex-100法提取瓶口56.25%的成功率相當(dāng)。但此方法將DNA檢材的載體、核膜及其他試劑一起保留在同一離心管中，不能有效去除雜質(zhì)，降低了DNA的純度，可能抑制下游的PCR擴(kuò)增，從而導(dǎo)致檢出率下降。暢晶晶等[3]分別采用6種不同的方法提取全血DNA，通過試驗證明常規(guī)Chelex-100法所得DNA模板的純度較低。因此Chelex-100法通常只適用于污染輕、雜質(zhì)少、DNA含量高、載體體積小的常規(guī)檢材的DNA提取，而在污染、腐敗、微量檢材的處理上存在很大的局限性。如筆者使用該方法處理工具手柄及繩索衣物類檢材時，檢出率較低，分別為33.33%、13.33%，明顯低于QIAcube純化法的72.22%、80.00%。

QIAamp DNA Investigator試劑盒使用的MinE-lute離心柱，上面的硅膠膜既能與DNA硅膠膜特異性結(jié)合，又能濾去大顆粒雜質(zhì)與可溶性PCR抵制物，最后使用小體積ATE緩沖液洗脫，得到不含蛋白質(zhì)、核酸酶和抑制劑的DNA濃縮液，有利于下游的PCR擴(kuò)增。QIAcube核酸自動化提取儀將上述裂解、結(jié)合、清洗、洗脫操作流程實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化、封閉化、全自動化，避免人為操作帶來的誤差、污染等問題，使DNA檢驗快速、準(zhǔn)確、可重復(fù)。從DNA提取的原理來看，QIAcube純化法能更有效地釋放DNA，而且可以有效去除模板DNA中的雜質(zhì)，同時兼具濃縮富集功能，因而可以獲得更純、濃度更高的DNA模板。從實際檢驗效果來看，使用該方法提取DNA不僅檢出率明顯高于Chelex-100法，而且其圖譜峰高也明顯高于Chelex-100法。此外，對于純化過的微量DNA樣本，通常使用小體系平行擴(kuò)增同時適當(dāng)增加循環(huán)次數(shù)來提高其檢測的靈敏度[4]，但同時也會伴隨著等位基因插入、等位基因丟失、stutter產(chǎn)物增加等問題，需要謹(jǐn)慎判別圖譜。

[1]鄭秀芬.法醫(yī)DNA分析[M].北京：中國人民公安大學(xué)出版社，2002：38-39.

[2]楊電，劉超，徐曲毅，等.微量口腔脫落細(xì)胞檢材的DNA檢驗[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2008，24（2）：126-128.

[3]暢晶晶，張素華，李莉.全血中DNA 6種提取方法的比較[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2009，25（2）：109-111，114.

[4]張璐，王保捷，丁梅，等.循環(huán)次數(shù)與體系對DNA檢測靈敏度的影響[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2013，29（2）：125-126.

DF795.2

B

10.3969/j.issn.1004-5619.2015.02.018

1004-5619（2015）02-0148-02

2013-12-18）

（本文編輯：李成濤）

廖長青（1982—），男，湖南懷化人，主檢法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)物證檢驗及鑒定工作；E-mail：35046786＠qq.com