樟樹花粉致變應性鼻炎小鼠模型的建立

張美幸， 謝亦璘， 冷蓓崢， 喬中東， 王蓮蕓， 閆曉梅

(1. 上海交通大學 生命科學技術學院，上海200240;2. 上海市第五人民醫(yī)院 呼吸科，上海200240)

0 引 言

植物類變應原有吸入性、食入性和接觸性3 種，其中吸入性植物變應原主要是空氣中廣泛存在的花粉。在I 型變態(tài)反應疾病患者中，大約有40%的病人與花粉的接觸有關［1］。樟樹(Cinnamomum camphora (L.)Presl.)為樟科樟屬的常綠大喬木，廣泛分布于中國長江以南各地。樟樹花期為5 月，每年春季大量散發(fā)極其微小的花粉顆粒，可能是我國南方地區(qū)的一種過敏原［2］。在上海地區(qū)，樟樹和法國梧桐已經成為城市的兩種主要行道樹。通過對上海市西南部郊區(qū)空氣中氣傳花粉的調查，發(fā)現樟樹花粉是當地春季空氣中飄散的優(yōu)勢花粉［3］。宋娟娟等［4］從樟樹花粉中克隆到的一個泛變應原基因——Profilin，暗示樟樹花粉可能會引起人類產生過敏反應。然而，對于樟樹花粉能夠引起人類過敏的直接證據卻鮮有報道，目前尚無資料直接顯示I 型變態(tài)反應疾病患者中對樟樹花粉過敏的比例，也未發(fā)現相關的動物實驗研究。因此，研究樟樹花粉是否是上海地區(qū)的花粉過敏原具有重要的意義。本研究選取小鼠作為模式生物開展樟樹花粉的致敏性檢測。結果發(fā)現，致敏組小鼠出現了過敏性鼻炎癥狀且相關組織學和血清學檢測陽性，說明樟樹花粉可以在一定程度上使部分小鼠患上過敏性鼻炎。本文在檢測樟樹花粉致敏性的同時也建立了樟樹花粉致過敏性鼻炎小鼠的模型，為今后進一步的實驗探究打下了基礎。

1 實驗材料與方法

1.1 樟樹花粉的采集

2011 ～2013 年的5 月初于樟樹盛花期在上海交通大學閔行校區(qū)采摘樟樹花，室溫22℃平鋪晾干，研磨后過200 目篩，得到粗花粉，分裝，于液氮中儲存?zhèn)溆?。粗花粉經Percoll(Sigma)密度梯度離心獲得純度為95%以上花粉。

1.2 樟樹花粉形態(tài)的掃描電子顯微鏡觀察

花粉經常規(guī)2.5%戊二醛(C5H8O2)固定液(pH 7.2 ～7.3)于4℃固定過夜(10 ～15 h)。磷酸鹽緩沖液清洗3 次后分別于20%、50%、70%、90%、95%、100%系列乙醇中脫水，其中100%乙醇需換液3 次。脫水完畢后將離心管打開管蓋置于干燥的通風櫥中，用自然干燥法使乙醇充分揮發(fā)為止(約2 h)。取少量花粉放于LEICA 顯微鏡和FEI Nova NanoSEM 場發(fā)射掃描電子顯微鏡下觀察和攝影。

1.3 樟樹花粉蛋白質提取液的制備

花粉加入含有多種蛋白酶抑制劑 Cocktail(Roche)和苯甲基磺酰氟(PMSF)的細胞裂解液(Cell Signaling)，冰浴中勻漿碾磨20 min，離心。取上清液用蛋白質濃度測定試劑盒(Bio-Rad)定量。

1.4 樟樹花粉致敏小鼠

7 ～8 周BALB/c 健康小鼠，體重(23 ±5)g，雌性，購買于上海交通大學動物實驗中心。小鼠隨機分成2組:樟樹花粉組和陰性對照組，每組10 只。樟樹花粉組采用2 mg/mL 的樟樹花粉蛋白質提取液與等量的弗氏完全佐劑(FCA)混合，分別于腹腔和背部皮下4點注射，每點50 μL。陰性對照組采用同種方法用PBS(pH7.4)經腹腔和皮下多點注射。每組小鼠分別在第8、15、22 d 用2 mg/mL 樟樹花粉蛋白質提取液與弗氏不完全佐劑(FIA)混合液或PBS 進行加強。在第29、30、31、32、33 d 用4 mg/mL 的樟樹花粉蛋白質進行滴鼻激發(fā)，30 μL/只。每次激發(fā)30 min 內觀察小鼠是否打噴嚏流鼻涕，抓鼻等癥狀。

1.5 小鼠鼻部癥狀的觀察及評分

末次激發(fā)完成后30 min 內觀察小鼠癥狀。按下列描述給每只小鼠計分:①流鼻涕。流至前鼻孔1分;超過前鼻孔2 分;淚流滿面3 分。②噴嚏。4 個以內1 分;4 ～10 個2 分;11 個以上3 分。③抓鼻次數。輕度抓鼻1 分;頻繁抓鼻2 分;抓鼻不止3 分。④哮喘。呼吸急促1 分;明顯喘息2 分;喘息致死3 分。以疊加法記分，總分超過5 分者為模型成功［5］。

1.6 小鼠血清的提取

小鼠末次激發(fā)30 min 后觀察癥狀完畢，以0. 1 mL/20 g 小鼠體重的劑量用5%的巴比妥那麻醉小鼠，待小鼠無疼痛反應后，立刻心臟取血。小鼠血液經37℃水浴1 h，4℃放置2 h，4℃下5 000 g 離心15 min，取上清即為血清。56℃水浴30 min，滅活補體后于－20℃下分裝貯藏備用。

1.7 小鼠鼻腔分泌物涂片

小鼠心臟取血后，用小棉棒試鼻腔分泌物涂片，95%乙醇固定后進行H＆E 染色并觀察。

1.8 鼻黏膜組織學觀察

小鼠心臟取血后迅速打開鼻背，取雙側鼻組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，H＆E 染色，光鏡下觀察。

1.9 小鼠血清IgE 的測定

小鼠血清和IgE 標準用pH9.6 的碳酸鹽緩沖液分別稀釋100 倍和逐級稀釋，100 μL/孔加入酶標板中，設3 個復孔，同時以PBS 為陰性對照。4℃過夜，以0.05%Tween20-TBS 洗3 遍。5%的脫脂奶粉-TBS 100 μL/孔室溫封閉1 h，洗3 遍。加入1∶2 000 稀釋的羊抗鼠IgE-HRP(Abcam)，濕盒中37℃孵育1 h，TTBS 洗3 遍。加入TMB 顯色液(北京康為)室溫下避光顯色15 ～30 min，加入50 μL 0.5 mol/L H2SO4終止顯色。將酶標板置于酶標儀中，450 nm 波長下讀取數據。以IgE 標準曲線換算血清中總IgE 的濃度。

1.10 數據處理

所有計量資料采用珋χ±s 表示，均數差異的顯著性采用SPSS 19.0 統計軟件檢驗。

2 結 果

2.1 樟樹花粉的顯微形態(tài)

用Leica 高精度光學顯微鏡和FEI Nova NanoSEM場發(fā)射掃描電子顯微鏡對花粉粒進行了形態(tài)學觀察。圖1 顯示樟樹花粉呈球形，大小約18 μm，表面分布均勻且緊密的突起狀小刺。小刺呈三角形，長約1 μm，基部膨大?；ǚ壅w外表似榴蓮，未見萌發(fā)孔，具有典型的樟科植物花粉特征［6］。

圖1 樟樹花粉的光學顯微鏡和掃描顯微鏡觀察

2.2 小鼠過敏反應癥狀評分

經過觀察計分，樟樹花粉致敏組的大部分小鼠出現了用前爪頻繁抓鼻并伴有頻繁噴嚏等癥狀，有的小鼠30 min 內噴嚏數達到54 個。經綜合評分有7 只小鼠大于5 分(見圖2)。PBS 對照組小鼠除了在激發(fā)5 min 之內有輕微抓鼻現象外，均無明顯癥狀。

圖2 樟樹花粉蛋白質提取液免疫并激發(fā)小鼠后小鼠過敏性鼻炎反應癥狀評分結果

2.3 小鼠鼻腔分泌物涂片的嗜酸性粒細胞染色

樟樹花粉組小鼠的鼻分泌物較多且呈清澈水樣，涂片中有大量的炎性細胞，其中有散在的嗜酸性粒細胞(圖3(a));而PBS 組小鼠的鼻腔干燥，鼻分泌物稀少，涂片則僅見少量上皮細胞(圖3(b))。

圖3 樟樹花粉蛋白質提取液免疫并激發(fā)小鼠后，鼻分泌物涂片的HE 染色觀察(×400)

2.4 小鼠鼻黏膜組織學觀察

將小鼠鼻組織進行固定和石蠟包埋，切片后染色觀察。樟樹花粉組的小鼠鼻組織黏膜層發(fā)現組織細胞間隙有大量的炎性細胞浸潤，血管周圍有炎性細胞滲出，整個黏膜層由于組織充血水腫而厚度增加(圖4(a))。PBS 陰性對照組小鼠的鼻黏膜層中細胞排列整齊，腺腔結構分明，無炎性細胞的浸潤(圖4(b))。

圖4 樟樹花粉蛋白質提取液免疫并激發(fā)小鼠后，鼻組織切片的HE 染色觀察(×400)

2.5 小鼠血清IgE 的測定

ELISA 法測定樟樹花粉蛋白質提取液和PBS 分別免疫后的兩組小鼠血清中IgE 的含量如圖5 所示，樟樹花粉致敏組小鼠血清IgE 的含量明顯較對照組升高，且差異性顯著(P ＜0.05)。

圖5 樟樹花粉蛋白質提取液和PBS 分別免疫后的小鼠血清中IgE 的含量

3 討 論

空氣致敏花粉的污染主要有區(qū)域性和季節(jié)性兩大特點。不同國家和地區(qū)因種植或生長的植物不同，從而使氣傳致敏花粉的種類和含量有顯著差異。此外，不同季節(jié)開花植物的種類、數量和開花期也影響空氣中花粉的種類和濃度［7］。在木本、草本和雜草類花粉中，雜草類花粉致敏性最強，草本次之，木本最弱。致敏花粉具有風媒花、花小、花粉量大、花粉粒小且質量輕的特點，因此風力、溫度和濕度等自然條件都會影響花粉的散發(fā)和傳播。隨著國內大力推進城市化建設，在城市綠地植物的選種和配置時未充分考慮花粉致敏植物的不利影響，使得大量花粉致敏植物在城市中聚集，對城市居民的健康構成威脅，如上海市中心區(qū)以法國梧桐(Platanus acerifilia)為主要綠化行道樹［8］。法國梧桐花期較長，常為3 月底至6 月初，花粉傳播較廣，且已被多數學者證實具有致敏性。楊雪源等［9］采用德國“敏篩”定量過敏原檢測系統對322 例蕁麻疹患者進行了特異性IgE 及過敏原檢測和分析，發(fā)現15.5% 的患者對梧桐樹花粉過敏?；ǚ酆?、多糖、脂類、蛋白質和多肽等成分，其中最主要的致敏成分是蛋白質。目前已經鑒定出梧桐花粉中的蛋白質變應原Pla a1 和Pla a2。Pla a1 是一種相對分子質量為18 kD的堿性蛋白質，由α、β 兩條多肽鏈組成，92%的法國梧桐花粉癥患者對Pla a1 變應原蛋白敏感［10，11］。Ibarrola 等報道了法國梧桐花粉的另一種變應原Pla a2，相對分子質量43 kD，具有糖基水解酶的活性，83%的法國梧桐花粉癥患者血清中可檢測到針對Pla a2 蛋白的抗體［12］。

在上海城市化建設的郊區(qū)，如西南部區(qū)域，現大面積種植樟樹，每年5 月初，樟樹開出無數細密的小花，散發(fā)大量的小到只有十幾μm 的花粉。隨之產生的問題是高密度集中種植的樟樹每年春季散發(fā)的花粉是否成為西南部空氣中主流的氣傳花粉?為此，本研究小組于2009 年3 月～2010 年2 月系統調查了上海市西南部郊區(qū)氣傳花粉的分布規(guī)律，共鑒定出植物氣傳花粉48 個科、55 個種屬。研究發(fā)現，春季3 ～5 月呈現全年第1 個花粉高峰，以樟屬(7. 55%)、桑科(8.05%)等樹木類花粉為主，樟樹花粉是春季空氣中飄散的相對優(yōu)勢花粉［3］。同時，本研究小組通過流行病學分析發(fā)現2009 ～2011 年的春季5、6 月是西南部郊區(qū)過敏性鼻炎和哮喘的高發(fā)時間段。通過曲線擬合發(fā)現西南部郊區(qū)春季5 月是樟樹花粉的濃度高峰，同時也是過敏性鼻炎和哮喘的高發(fā)期(數據待發(fā)表)。這些數據讓研究小組隨之產生了疑問:樟樹花粉是否會引起人類或動物發(fā)生變態(tài)反應?是否含有新型的過敏原?過敏原的特點是什么?等等。這些問題都需要開展相關的實驗探究來解決。

國內外大量的實驗證據證明小鼠、豚鼠、大鼠等可用作研究蛋白質導致過敏的模型。Tanaka 等［13］用10%TDI(2，4-Toluene Disocyanate)鼻內吸入法建立了過敏性鼻炎豚鼠模型。Takahashi 等［14］用卵清蛋白建立了過敏性鼻炎的大鼠模型。余洪猛等［15］用豚草花粉提取物建立了過敏性鼻炎豚鼠模型等等。國際生命科學研究院健康與環(huán)境研究所的蛋白質過敏技術委員會于2000 年開始組織研究了4 個不同品種的小鼠(A/J，BALB/c，BDF1，C3H/Hel)模型，用來檢測蛋白質引起的過敏反應。與其他的動物模型相比，小鼠具有兩大優(yōu)點:①相對容易飼養(yǎng)，費用低;②小鼠的抗體決定簇與人類有一定的相似性［16-17］。因此，本研究小組首先選用BALB/c 小鼠作為實驗模型對樟樹花粉的致敏性開展探究。

首先對樟樹花粉進行了顯微觀察，花粉直徑約18 μm，表面分布均勻且緊密的突起狀小刺，未見萌發(fā)孔。為了驗證樟樹花粉是否能夠引起過敏性癥狀如過敏性鼻炎，研究小組采摘純化花粉并提取花粉全蛋白質后，通過腹腔和皮下多點注射免疫BALB/c 小鼠，而后采用滴鼻的方法激發(fā)小鼠。通過光學顯微鏡觀察鼻分泌物涂片和鼻部組織切片發(fā)現，鼻分泌物中的嗜酸性粒細胞明顯增多，鼻黏膜層明顯充血增厚，炎性細胞浸潤，結果均顯示樟樹花粉使小鼠產生了過敏性鼻炎的癥狀。另外，對實驗小鼠血清中的IgE 進行了檢測，發(fā)現樟樹花粉致敏小鼠血清中IgE 含量明顯上升，這也是小鼠發(fā)生過敏反應的重要指標之一。

4 結 語

本文成功建立了樟樹花粉致過敏性鼻炎小鼠動物模型，說明樟樹花粉會引起部分體質敏感的小鼠個體發(fā)生過敏性鼻炎癥狀。這為進一步探索樟樹花粉對人類的致敏性、致敏組分以及致敏機制等奠定了良好的基礎。致謝 感謝李朔、孟靖和張嘉偉對研究工作所做的貢獻。

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