UFLC法測定人血漿中喹硫平及氯氮平的濃度

顏學方 楊春花 楊東瓊

（云南省曲靖市第三人民醫(yī)院，云南 曲靖 655000）

UFLC法測定人血漿中喹硫平及氯氮平的濃度

顏學方 楊春花 楊東瓊

（云南省曲靖市第三人民醫(yī)院，云南 曲靖 655000）

目的在HPLC法測定人血漿中氯氮平濃度的基礎(chǔ)上建立UFLC法同時測定氯氮平及奎硫平濃度。方法血漿樣品經(jīng)適當處理，色譜柱為shim-pack XR-ODSш柱，流動相為0.4%三乙胺溶液-甲醇（45∶55，v/v），流速0.4 mL/min，檢測波長257 nm。結(jié)果測定方法在50～1600 μg/L范圍內(nèi)，氯氮平、奎硫平線性關(guān)系良好（氯氮平r=0.9999，喹硫平r=0.9993）；日內(nèi)、日間相對標準誤差（RSD）在3.0%～6.5%。結(jié)論本方法快速、簡便、準確，可用于血藥濃度監(jiān)測。

氯氮平；超快速液相色譜法；血藥濃度

富馬酸喹硫平（quetiapine fumarate，喹硫平）為新型典型抗精神病藥。喹硫平的化學結(jié)構(gòu)類似于氯氮平或奧氮平，在藥物效應(yīng)動物模式上類似于氯氮平。大量臨床研究表明，該藥是一種有效且安全的抗精神病藥[4-7]。目前尚未見采用超快液相色譜法（UFLC）同時檢測喹硫平和氯氮平血藥濃度的報道。我們在HPLC法測定人血漿中氯氮平濃度的基礎(chǔ)上，建立UFLC法同時測定及氯氮平及奎硫平的濃度，為神經(jīng)、精神疾病患者的合理用藥提供依據(jù)。

本方法快速、簡便、準確，可用于血藥濃度監(jiān)測。

1 儀器與試藥

日本島津超高效液相色譜儀系統(tǒng)（LC-30AD二元泵、SPD-20A 紫外可見光光度檢測器、LC-20A 色譜工作站、CTO-30A柱溫箱、色譜柱為shim-pack XR-ODSш柱、DGU-20A5在線脫氣機、SIL-30AC自動進樣器）；Sartorius BSA224S電子分析天平（德國賽多利斯股份有限公司）；TDZ5-WS型自動平衡離心機（湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司）；IKA Vortes Genius 3型旋渦混合器（廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司）；MTN-2800D氮吹濃縮裝置（天津奧塞恩斯儀器有限公司）：AS10200AT超聲波清洗器（天津奧塞恩斯儀器有限公司）；芬蘭Finnpipette F1系列微量移液器。氯氮平對照品（江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司提供，批號：20120602）；富馬酸喹硫平照品（湖南洞庭藥業(yè)股份有限公司提供批號：20120711）；甲醇為進口色譜純（TEDIA COMPANY，USA）；其他試劑均為分析純；自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件：色譜柱：shim-pack XR-ODSш(1.6 μm，2.0 mm×75 mm)；流動相：0.4%三乙胺溶液-甲醇(45∶55，v/v)；流速：0.4 mL/min；檢測波長：257 nm；進樣量：5 μL；柱溫：40 ℃。

圖1 喹硫平色譜峰

圖2 氯氮平色譜峰

圖3 喹硫平氯氮平對照品色譜峰

表1 回收率、日內(nèi)、日間精密度（，n=5）

表1 回收率、日內(nèi)、日間精密度（，n=5）

藥物 加入濃度(μg/L) 相對回收率(%) 日內(nèi)精密度 日間精密度測定值(μg/L) RSD(%) 測定值(μg/L) RSD(%)氯氮平100 102.95 102.28±5.68 3.35 104±7.91 6.25 200 99.33 198.66±7.98 4.50 205.71±8.15 6.45 400 97.40 389.59±10.68 5.87 396.49±11.01 6.00喹硫平100 97.83 96.94±4.74 4.43 97.04±6.43 5.10 400 101.37 405.47±7.48 5.31 397.60±9.01 6.40 800 101.14 809.14±.36.48 6.12 792.45±37.55 6.50

2.2 氯氮平對照液配制：精密稱取氯氮平10 mg，置于100 mL 量瓶中，用甲醇溶解至刻度，搖勻，即得100 μg/mL 的對照品儲備液（4 ℃避光保存）。精密吸取此液10.0 mL于100 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得10 μg/mL的氯氮平對照品溶液。

2.3 喹硫平對照品儲備液與工作液的配制：精密稱取喹硫平對照品10 mg，置100 mL量瓶中，加1 mol/L鹽酸1 mL溶解，再加甲醇至刻度，搖勻，作為儲備液，濃度為100 μg/mL。精密吸取此液10.0 mL于100 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得10 μg/mL的喹硫平對照品溶液。

2.4 血漿樣品預處理：取血漿樣品，1.0 mL，加1 mol/L氫氧化鈉溶液100 μL，旋渦混勻30 s，用2 mL +2 mL +2 mL重蒸乙醚分3次萃取，每次 3500 r/min離心5 min，收集上層有機層置于10 mL尖底試管中，45 ℃氮氣吹干，加100 μL甲醇漩渦2 min，超聲溶解2 min。吸取藥液用2.2 μm有機相針式過濾器過濾，進樣5 μL。

2.5 標準曲線的繪制：取10 mL 具塞離心管7只，分別加入10 μg/mL（即10000 μg/L）喹硫平及氯氮平對照品溶液各5、10、20、40、80、100、160 μL，用空白血漿將各管補齊1 mL，使各管喹硫平及氯氮平對照品的濃度分別為50、100、200、400、800、1000、1600 μg/L，加1.0 mol/L氫氧化鈉溶液100 μL，旋渦混勻30 s，用2 mL +2 mL +2 mL重蒸乙醚分3次萃取，每次3500 r/min離心5 min，收集上層有機層置于10 mL 尖底試管中，45 ℃氮氣吹干，加100 μL甲醇定容，漩渦2 min，超聲溶解2 min。吸取藥液用2.2 μm有機相針式過濾器過濾，進樣5 μL，分別以對照品喹硫平及氯氮平峰面積（X）對血漿中對照品喹硫平及氯氮平濃度（Y）進行線性回歸，得回歸方程分別為：喹硫平Y(jié)=0.00507 X-14.707，r=0.9993；氯氮平Y(jié)=0.00221 X+2.4787，r=0.9999。結(jié)果顯示本法在50～1600 μg/L范圍內(nèi)，喹硫平及氯氮峰高比與濃度均呈良好線性關(guān)系，最低檢測限為10 μg/L。見圖1～圖3。

2.6 回收率和精密度試驗：按“2.4”項下方法配制高、中、低濃度的含藥血漿，照血樣處理方法操作，每種濃度進行5次日內(nèi)平行測定；每種每日進行1次測定，共5次。對日內(nèi)、日間的精密度進行計算，并依據(jù)1 d內(nèi)高中低3個濃度血漿的標準品結(jié)果，對回收率進行計算；另外還應(yīng)采用流動相制備出相同濃度的溶液，對兩種藥物的絕對回收率進行計算。結(jié)果見表1。

3 討 論

3.1 分別考察了0.4% 三乙胺溶液-甲醇（40∶60，v/v）、0.4% 三乙胺溶液-甲醇（45∶55，v/v），結(jié)果表明，前者氯氮平在9 min出峰，喹硫平在7 min出峰，后者氯氮平在12 min出峰，喹硫平在9 min出峰，但前者在低濃度時，血清基質(zhì)對其干擾較為嚴重，而改變水相及有機相的濃度，將保留時間后移即可解決此問題。試驗發(fā)現(xiàn)，0.4%三乙胺溶液-甲醇（45∶55，v/v）為佳。實驗中發(fā)現(xiàn)使用Inertsil ODS-SP（5 μm，4.6 mm ×150 mm）色譜柱，流速1.0 mL/min，壓力在15～20 mPa，保留時間二者均在20 min后，不適宜臨床做大批量檢測。筆者使用shim-pack XRODSш（1.6 μm，2.0 mm×75 mm）柱，流動相：0.4%三乙胺溶液-甲醇（45∶55，v/v），流速：0.4 mL/min，壓力在69～75 mPa（島津LC-30AD二元泵最大支持130 mPa），將時間調(diào)整在9～13 min，既排除了干擾，又節(jié)省了時間。

3.2 喹硫平的化學結(jié)構(gòu)類似于氯氮平或奧氮平，在藥物效應(yīng)動物模式上類似于氯氮平結(jié)構(gòu)相似，易溶于乙醚、甲醇等，為將二者選用相同分析條件找到依據(jù)，筆者曾使用安定為內(nèi)標，但實驗中發(fā)現(xiàn)用2 mL+2 mL+2 mL重蒸乙醚分3次萃取較為完全，配制80 μg/L、300 μg/L、600 μg/L質(zhì)控液連續(xù)21 d隨患者樣本同時處理，發(fā)現(xiàn)結(jié)果穩(wěn)定，3個不同濃度質(zhì)控均在允許范圍內(nèi)，故放棄使用內(nèi)標物。

3.3 在對萃取物殘渣進行溶解時，發(fā)現(xiàn)單純的漩渦混勻不能將藥物完全溶解，而將藥液漩渦后超聲2 min即可有效解決。

3.4 氯氮平、富馬酸喹硫平治療不同時期精神分裂癥患者的量效關(guān)系有待研究，其血藥濃度的監(jiān)測對于避免毒性反應(yīng)、分析療效不佳原因、調(diào)整藥物劑量、預測臨床療效等有一定的臨床意義。建立該方法可對兩種藥物在不同組之間做療效對比時，實驗室可將兩組患者的樣本同時測定，避免樣本儲存或不同時間采樣產(chǎn)生的對比誤差。

[1]Alvir JM,Lieberman JA,Safferman AZ,et al.Clozapine-induced agranulocytosis.Incidence and risk factors in the United States[J]. N Engl Med,1993,329(3):162-167.

[2]Lovdahl MJ,Perry PJ,Miller DD.The assay of clozapine and Ndesmethylclozapine in human plasma by high-performance liguid chromatography[J].Ther Drug Monit,1991,13(1):69-72.

[3]余自成.氯氮平血藥濃度快速測定方法的研究[J].藥物分析雜志,1998,18(6):388-390.

[4]Hirsh S R,Link C G,Goldstein JM,et al.ICI 204,636:a new antipsy-chotic drug[J].Br J Psychiatry,1996,168(Suppl 29):45.

[5]DeVane C L,NemeroffC B.Clinical pharmacokinetics ofquetiapine: all atyp-ical anti-psychotic[J].C1in Pharmacokinet,2001,40(70):509.

[6]KasperS,Müller-Spahn F..Renew ofquetiapine andits clinical applicationsin schizophrenia[J].Expert Opin Pharmacother,2001,1(4): 783.

[7]Harmner M B,Arvanitis L A,Miller B G,et a1.Plasma pmlacfin in$chizo-phrenia subjects treated with seroquel(ICl204636)[J]. Psychopharmacol Bull,1996,32(1):107.

UFLC Method for the Determination of Human Plasma of Quetiapine and Clozapine Concentration

YAN Xue-fang, YANG Chun-hua, YANG Dong-qiong
(Qujing Third People's Hospital of Yunnan, Qujing 655000, China)

ObjectiveIn the HPLC method for the determination of human plasma clozapine concentration on the basis of the establishment of UFLC method for simultaneous determination of clozapine and quetiapine.MethodsPlasma samples with appropriate treatment, the column was shim-pack XRODSш column, the mobile phase was 0.4% three triethylamine solution- methanol(45∶55, V/V), the flow rate was 0.4 mL/min, the detection wavelength was 257 nm.ResultsMethod of determination in 50～1600 μg/L range, clozapine, quetiapine good linear correlation(clozapine, r=0.9999, quetiapine, r=0.9993); days, day relative standard deviation (RSD)in 3.6%～5.7% between.ConclusionThe method is quick, simple, accurate, and can be used for monitoring of serum drug concentration.

Clozapine; UFLC; Plasma drug level

R927.1

B

1671-8194（2015）02-0045-02