• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    家兔DGAT1基因的克隆及其組織表達(dá)譜分析

    2015-12-23 09:38鄺良德任永軍謝曉紅雷岷李叢艷
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年10期
    關(guān)鍵詞:家兔克隆沉積

    鄺良德 任永軍 謝曉紅 雷岷 李叢艷 鄭潔 郭志強(qiáng) 張翔宇 張翠霞 楊超 李勤 陳天寶

    摘要:采用RT-PCR技術(shù)克隆家兔DGAT1部分基因片段,并采用半定量RT-PCR技術(shù)研究其在齊興肉兔不同組織中的表達(dá)譜。研究結(jié)果獲得了DGAT1基因960 bp的編碼序列,共編碼320個氨基酸。通過核苷酸和氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn),家兔DGAT1基因與其他物種的相似性在81.7%~89.2%之間;遺傳距離分析表明,家兔與人的親緣關(guān)系最近,與牛的最遠(yuǎn)。組織表達(dá)譜分析表明,DGAT1基因在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、盲腸、淋巴結(jié)、背最長肌、皮下脂肪等多種組織中均有表達(dá),且皮下脂肪中表達(dá)量最高,肺臟組織中表達(dá)量最低。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究DGAT1基因在家兔脂肪代謝中的生理功能提供依據(jù)。

    關(guān)鍵詞:家兔;二?;视娃D(zhuǎn)酰基酶1(DGAT1);半定量RT-PCR;組織表達(dá);基因序列;遺傳距離

    中圖分類號: S829.12 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號:1002-1302(2015)10-0041-03

    二酰基甘油?;D(zhuǎn)移酶(diacylglycerolacyltransferase,DGAT)是脂肪細(xì)胞中甘油三脂合成過程中最后一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶,在細(xì)胞甘油脂類的代謝中起重要作用,其作用機(jī)制是使二?;视停╠iacylglycerol,DAG)作用于脂肪酸?;纬扇8视停╰riacylglycerol,TAG)[1]。研究表明,DGAT基因?qū)游锛∪夂腿橹兄竞恳约爸舅峤M成有顯著影響,敲除DGAT1基因的小鼠雖然在腸內(nèi)能繼續(xù)合成甘油三酯,但不能在組織中沉積,也不能泌乳[2-6]。DGAT有2種類型:DGAT1和DGAT2,兩者有54%的同源性,但是分屬于不同的基因家族。DGAT1屬于包括?;o酶A、膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶ACAT1和ACAT2在內(nèi)的蛋白家族,在很多組織中都有表達(dá),特別是在小腸、睪丸、脂肪、乳腺和皮膚中的表達(dá)量最高[7]。在小鼠上研究表明DGAT1的表達(dá)量與小鼠的肥胖程度及脂肪組織和骨骼肌中脂肪酸的含量及成分有關(guān)[8-9]。在牛上研究發(fā)現(xiàn)DGAT1基因的K232A突變對奶牛產(chǎn)奶性狀,尤其是乳脂量具有顯著影響[10,11]。Wu等研究結(jié)果表明,DGAT1基因?qū)ε5钠は轮居屑有孕?yīng)[12]。豬上的研究表明,DGAT1基因定位在SSC4p15,在這一區(qū)域內(nèi)存在可能影響豬生長速度、肌內(nèi)脂肪含量和脂肪酸組成的QTL[13-14]。

    關(guān)于DGAT1基因的定位和結(jié)構(gòu),國內(nèi)外學(xué)者在許多物種上進(jìn)行了深入細(xì)致的研究。人的DGAT1基因定位于HSA8q24.3,DNA總長度10 588 bp,含有17個外顯子和16個內(nèi)含子。小鼠的DGAT1基因位于15號染色體D3區(qū),遺傳位置是46.9 cM,含有17個外顯子,16個內(nèi)含子。牛DGAT1基因位于14號染色體19 cM處,與微衛(wèi)星CSSM66緊密連鎖,基因全長14 117 bp,含有17個外顯子和16個內(nèi)含子。豬DGAT1基因定位于SSC4p15,與微衛(wèi)星SW2404緊密連鎖,cDNA全長1 935 bp[15-16]。目前,在家兔(Oryctolagus cuniculus)DGAT1基因研究方面,僅見 GenBank 上其基因預(yù)測序列的公布,有關(guān)家兔該基因的表達(dá)尚屬空白。本研究旨在通過RT-PCR技術(shù)對齊興肉兔DGAT1基因的cDNA進(jìn)行克隆,并利用半定量RT-PCR 技術(shù)分析DGAT1基因在不同組織中的表達(dá)規(guī)律,為該基因在家兔肌肉組織脂質(zhì)代謝中的功能研究提供基礎(chǔ)資料。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 動物及組織樣本采集 選取成年健康齊興肉兔公兔5只,來自四川省畜牧科學(xué)研究院種兔場。屠宰后立即采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、盲腸、淋巴結(jié)、背最長肌、皮下脂肪等組織樣品置于液氮中速凍,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.1.2 主要儀器及試劑 電動勻漿器(瑞士Polytron PT1200E)、Power Pac 3000電泳儀(Bio-Rad)、日本日立CR22g高速冷凍離心機(jī)、英國Biochrom公司的WPA Biowave核酸蛋白檢測儀、Versa Doc 1000凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)。主要試劑包括Trizol試劑(Invitrogen)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ferments)、pMD19-T質(zhì)粒(TaKaRa)等。

    1.2 方法

    1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中家兔DGAT1預(yù)測序列以及GAPDH mRNA序列,并采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計針對DGAT1基因的特異性克隆引物以及半定量RT-PCR引物(表1),引物均由上海生物工程有限公司合成。

    1.2.2 總RNA提取與cDNA模板合成 采用Trizol試劑法提取10種組織中的總RNA,用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量和完整性,質(zhì)量合格的RNA置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板參照TaKaTa公司PrimeScriptTM RT reagent Kit試劑盒說明,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 -20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.3 DGAT1基因的部分cDNA片段克隆 以凍存的肌肉組織cDNA為模板,PCR擴(kuò)增DGAT1基因部分cDNA片段。25 μL PCR反應(yīng)體系:滅菌超純水15.375 μL、2.5 mmol/L dNTP Mix 2 μL、PCR buffer 2.5 μL、25 mmol/L MgCl2 1.5 μL、cDNA 1.5 μL、10 μmol/L正反向引物各1 μL、5 U/μL Taq DNA聚合酶0.125 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性30 s,退火30 s(退火溫度見表1),72 ℃延伸30 s,共34個循環(huán);最后72 ℃充分延伸10 min,10 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并用DNA回收試劑盒回收目的條帶?;厥债a(chǎn)物連接于PMD19-T載體,轉(zhuǎn)化后篩選陽性克隆,提取質(zhì)粒并進(jìn)行測序。DNA測序由上海生物工程有限公司完成。

    1.2.4 DGAT1基因在齊興肉兔不同組織中的表達(dá)譜 利用凍存的齊興肉兔各組織cDNA為模板,進(jìn)行半定量RT-PCR擴(kuò)增。經(jīng)過對DGAT1基因、GAPDH基因的半定量PCR體系及條件優(yōu)化后,25 μL PCR反應(yīng)體系:其中滅菌超純水15.8 μL、PCR buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP Mix 2.0 μL、25 mmol/L MgCl2 1.5 μL、cDNA 1.0 μL、10 μmol/L正反向引物各1.0 μL、5 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL。PCR擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性30 s,退火30 s(退火溫度見表1),72 ℃延伸30 s,共33個循環(huán);最后72 ℃充分延伸10 min,10 ℃保存。產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離,用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照,并用Quantity one軟件分析,數(shù)據(jù)用DGAT1與GAPDH條帶的光密度比值表示。

    1.2.5 數(shù)據(jù)分析 利用BioXM 2.6、DNAMAN等軟件進(jìn)行核苷酸及氨基酸同源性比對分析;利用MEGA 5.1構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹;定量結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,統(tǒng)計分析軟件為SPSS 17.0。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 DGAT1基因片段擴(kuò)增以及重組質(zhì)粒的PCR檢驗

    采用RT-PCR方法對齊興肉兔DGAT1基因片段進(jìn)行擴(kuò)增,得到1條長度約為962 bp的特異性擴(kuò)增區(qū)帶,與預(yù)期片段大小一致(圖1)。擴(kuò)增片段經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)后,挑取重組子,對陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定(圖2),結(jié)果得到1條與設(shè)計片段一致的條帶,表明目的基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌中。

    2.2 DGAT1基因序列的同源性分析

    將克隆測序得到的齊興肉兔DGAT1基因序列片段(圖2)與GenBank中收錄的人(NM_012079)、牛(NM_174693)、小家鼠(NM_010046)、豬(NM_214051)、犬(NM_214051)、綿羊(NM_214051)和黑猩猩(NM_010046)等物種DGAT1基因相應(yīng)序列相比較,發(fā)現(xiàn)DGAT1基因在常見物種間存在較高的相似性,其核苷酸相似性分別為89.1%、89.2%、81.7%、88.7%、87.9%、89.0%和89.1%。結(jié)果表明:哺乳動物的DGAT1基因編碼區(qū)序列比較保守。

    2.3 基于系統(tǒng)進(jìn)化樹的DGAT1基因親緣關(guān)系分析

    將本試驗克隆測序所獲得的DGAT1基因片段序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中收錄的人(NM_012079)、牛(NM_174693)、小家鼠(NM_010046)、豬(NM_214051)、犬(NM_214051)、綿羊(NM_214051)和黑猩猩(NM_010046)等物種DGAT1基因相應(yīng)序列用BioXM 2.6生物信息軟件翻譯成氨基酸序列,再利用MEGA 5.1軟件對所得到的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對,采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。樹枝長度表示親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近,由圖可見,家兔與人具有最近的親緣關(guān)系,與牛的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

    2.4 DGAT1基因在齊興肉兔不同組織的表達(dá)分析

    采用GAPDH作為參照基因,采用半定量RT-PCR方法分別檢測了DGAT1基因mRNA在成年齊興肉兔不同組織中的表達(dá)情況,包括脂肪、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、回腸、胃、腎臟、大腦和肌肉共10個組織,結(jié)果(圖4)各組織中均表達(dá)DGAT1,DGAT1在脂肪組織中表達(dá)量最高, 并且脂肪、 肝臟以

    及回腸組織中的表達(dá)量極顯著高于其他組織(P<0.01)。

    3 討論與結(jié)論

    肌內(nèi)脂肪沉積作為當(dāng)今研究的熱點問題,其內(nèi)在分子機(jī)理尚未完全清楚。國內(nèi)外研究表明,肌內(nèi)脂肪的沉積主要是肌肉內(nèi)脂肪細(xì)胞對甘油三酯的合成與分解的綜合結(jié)果表現(xiàn),而參與脂肪合成和分解的脂肪代謝酶有許多種,因此,脂肪沉積的調(diào)控機(jī)制是一個十分復(fù)雜的過程[17-20]。DGAT1在調(diào)控脂肪代謝中起到重要作用,是甘油三酯合成過程中唯一的關(guān)鍵酶和限速酶,是肌內(nèi)脂肪沉積過程的重要參與者,其編碼基因的表達(dá)對肌內(nèi)脂肪沉積有著重要影響。目前,國內(nèi)外進(jìn)行了許多關(guān)于DGAT1基因的研究,但是有關(guān)家兔DGAT1基因的研究還未見報道。本試驗通過RT-PCR方法從肌肉組織中克隆得到了家兔DGAT1基因部分cDNA序列,此外,將該序列與NCBI收錄的其他物種DGAT1基因序列進(jìn)行同源性比對分析發(fā)現(xiàn),家兔DGAT1基因序列與其他常見物種間存在高度同源性,與牛、人和豬的DGAT1基因序列相比,相似性均在87%以上,將家兔DGAT1基因片段編碼氨基酸序列與其他常見物種相比,相似性均在95%以上,其中與人的核苷酸和氨基酸相似性均很高,與牛、綿羊的相似性較差。通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn),家兔與人具有最近的親緣關(guān)系,而其與牛的親緣關(guān)系最遠(yuǎn),這與傳統(tǒng)分類學(xué)的結(jié)果基本一致。

    本試驗中,半定量RT-PCR結(jié)果表明,DGAT1基因mRNA在成年齊興肉兔脂肪、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、回腸、胃、腎臟、大腦和肌肉中都有不同程度的表達(dá),其中在脂肪組織中表達(dá)量最高,在肺臟中表達(dá)量最低,這與王國富等在牛上的研究結(jié)果[21]稍有不同,這可能與物種的特異性有關(guān)??傊珼GAT1在齊興肉兔各組織中不同的mRNA表達(dá)豐度說明其對不同組織中脂肪含量有著不同程度影響,可作為一個影響兔肉品質(zhì)性狀的候選基因。雖然DGAT1基因的表達(dá)對于脂肪沉積有重要影響,但脂肪沉積是受到許多代謝酶調(diào)控的一個綜合過程,下一步作者將對參與脂肪合成和分解的其他多種酶類編碼基因的表達(dá)調(diào)控及遺傳變異進(jìn)行深入研究,以便進(jìn)一步揭示肉兔脂肪沉積的內(nèi)在機(jī)制,為培育新品種提供理論基礎(chǔ)。

    參考文獻(xiàn):

    [1]Nishizuka Y. Intracellular signaling by hydrolysis of phospholipids and activation of protein kinase C[J]. Science,1992,258(5082):607-614.

    [2]Buhman K K,Smith S J,Stone S J,et al. DGAT1 is not essential for intestinal triacylglycerol absorption or chylomicron synthesis[J]. The Journal of Biological Chemistry,2002,277(28):25474-25479.

    [3]Smith S J,Cases S,Jensen D R,et al. Obesity resistance and multiple mechanisms of triglyceride synthesis in mice lacking Dgat[J]. Nature Genetics,2000,25(1):87-90.

    [4]Conte G,Mele M,Chessa S,et al. Diacylglycerol acyltransferase 1,stearoyl-CoA desaturase 1,and sterol regulatory element binding protein 1 gene polymorphisms and milk fatty acid composition in Italian Brown cattle[J]. Journal of Dairy Science,2010,93(2):753-763.

    [5]Signorelli F,Orrù L,Napolitano F,et al. Exploring polymorphisms and effects on milk traits of the DGAT1, SCD1 and GHR genes in four cattle breeds[J]. Livestock Science,2009,125 (1):74-79.

    [6]Demeter R M,Schopen G C,Lansink A G,et al. Effects of milk fat composition,DGAT1,and SCD1 on fertility traits in Dutch Holstein cattle[J]. Journal of Dairy Science,2009,92(11):5720-5729.

    [7]Cases S,Smith S J,Zheng Y W,et al. Identification of a gene encoding an acyl CoA:diacylglycerol acyltransferase,a key enzyme in triacylglycerol synthesis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1998,95(22):13018-13023.

    [8]Chen H C,Smith S J,Ladha Z,et al. Increased insulin and leptin sensitivity in mice lacking acyl CoA:diacylglycerol acyltransferase 1[J]. The Journal of Clinical Investigation,2002,109(8):1049-1055.

    [9]Chen H C,Stone S J,Zhou P,et al. Dissociation of obesity and impaired glucose disposal in mice overexpressing acyl coenzyme a:diacylglycerol acyltransferase 1 in white adipose tissue[J]. Diabetes,2002,51(11):3189-3195.

    [10]Spelman R J,F(xiàn)ord C A,Mcelhinney P,et al. Characterization of the DGAT1 gene in the New Zealand dairy population[J]. Journal of Dairy Science,2002,85(12):3514-3517.

    [11]徐秀容,高 雪,許尚忠,等. 牛DGAT1基因K232A取代對3個品種奶牛群體部分經(jīng)濟(jì)性狀的影響[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2006,34(9):6-10.

    [12]Wu X L,Macneil M D,De S,et al. Evaluation of candidate gene effects for beef backfat via Bayesian model selection[J]. Genetica,2005,125(1):103-113.

    [13]Pérez-Enciso M,Clop A,Noguera J L,et al. A QTL on pig chromosome 4 affects fatty acid metabolism:evidence from an Iberian by Landrace intercross[J]. Journal of Animal Science,2000,78(10):2525-2531.

    [14]De Koning D J,Janss L L,Rattink A P,et al. Detection of quantitative trait loci for backfat thickness and intramuscular fat content in pigs (Sus scrofa)[J]. Genetics,1999,152(4):1679-1690.

    [15]Nonneman D,Rohrer G A. Linkage mapping of porcine DGAT1 to a region of chromosome 4 that contains QTL for growth and fatness[J]. Animal Genetics,2002,33(6):472-473.

    [16]馬海明,施啟順,柳小春.DGAT相關(guān)基因研究進(jìn)展[J]. 遺傳學(xué)報,2005,32(12):1327-1332.

    [17]楊海玲,曾勇慶,魏述東,等. 萊蕪豬脂肪代謝酶活性的發(fā)育性變化及其對肌內(nèi)脂肪沉積的影響[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2005,36(11):1150-1154.

    [18]Yamazaki T,Sasaki E,Kakinuma C,et al. Increased very low density lipoprotein secretion and gonadal fat mass in mice overexpressing liver DGAT1[J]. The Journal of Biological Chemistry,2005,280(22):21506-21514.

    [19]Horton J D,Goldstein J L,Brown M S. SREBPs:activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver[J]. The Journal of Clinical Investigation,2002,109(9):1125-1131.

    [20]Nakamura M T,Cheon Y,Li Y E,et al. Mechanisms of regulation of gene expression by fatty acids[J]. Lipids,2004,39(11):1077-1083.

    [21]王國富,吳慧光,孫國權(quán),等. 中國西門塔爾牛DGAT1和DGAT2基因組織表達(dá)譜及其在脂肪組織中的表達(dá)與背膘厚的關(guān)聯(lián)分析[J]. 華北農(nóng)學(xué)報,2012,27(5):60-64.危文波,蔣禮玲,吳昆侖,等. 青稞品種肚里黃成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(10):44-46.

    猜你喜歡
    家兔克隆沉積
    克隆狼
    家兔“三催”增效飼養(yǎng)法
    浙江:誕生首批體細(xì)胞克隆豬
    《沉積與特提斯地質(zhì)》征稿簡則
    《沉積與特提斯地質(zhì)》征稿簡則
    抗BP5-KLH多克隆抗體的制備及鑒定
    家兔常見皮膚病的防治
    家兔便秘的防治辦法
    化學(xué)浴沉積制備防污自潔型PVDF/PMMA共混膜研究
    国产三级在线视频| 性色avwww在线观看| 成年版毛片免费区| 又爽又黄无遮挡网站| 久久热精品热| 日本熟妇午夜| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 给我免费播放毛片高清在线观看| 可以在线观看的亚洲视频| 免费在线观看成人毛片| 午夜福利视频1000在线观看| 99久国产av精品国产电影| 成年免费大片在线观看| 国产乱人偷精品视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 美女高潮的动态| 日本三级黄在线观看| 99精品在免费线老司机午夜| 最新在线观看一区二区三区| 免费黄网站久久成人精品| 韩国av在线不卡| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲成人久久爱视频| 久久国内精品自在自线图片| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 欧美成人免费av一区二区三区| 校园春色视频在线观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 波多野结衣巨乳人妻| av在线亚洲专区| 国产午夜精品论理片| 久久久久国产网址| 精品熟女少妇av免费看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 日韩制服骚丝袜av| 久久精品影院6| 久久久精品欧美日韩精品| 国产成人a∨麻豆精品| 在线免费十八禁| 国产精品久久久久久久久免| 久久久精品大字幕| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲电影在线观看av| 免费看a级黄色片| www.色视频.com| 一级毛片电影观看 | 一本久久中文字幕| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 色播亚洲综合网| 九色成人免费人妻av| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 极品教师在线视频| 午夜久久久久精精品| 中文字幕av在线有码专区| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产精品国产高清国产av| 久久久久久九九精品二区国产| 国产av在哪里看| 久久久成人免费电影| 长腿黑丝高跟| 免费人成视频x8x8入口观看| 性色avwww在线观看| 久久午夜亚洲精品久久| 观看美女的网站| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 简卡轻食公司| 99riav亚洲国产免费| 我要看日韩黄色一级片| 免费人成视频x8x8入口观看| 老司机影院成人| 国产日本99.免费观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 一级毛片我不卡| 啦啦啦啦在线视频资源| 日本一本二区三区精品| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲精品456在线播放app| 国产91av在线免费观看| 亚洲三级黄色毛片| 国产在线男女| 在线国产一区二区在线| 亚洲国产精品合色在线| 精品福利观看| 久久热精品热| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 一进一出好大好爽视频| 免费看美女性在线毛片视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 天天躁日日操中文字幕| 日本欧美国产在线视频| 久久99热6这里只有精品| 午夜久久久久精精品| 国产在线男女| 天天一区二区日本电影三级| 永久网站在线| 欧美日本亚洲视频在线播放| 婷婷六月久久综合丁香| 偷拍熟女少妇极品色| 毛片一级片免费看久久久久| 国产精品伦人一区二区| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲欧美日韩东京热| 又粗又爽又猛毛片免费看| 看非洲黑人一级黄片| АⅤ资源中文在线天堂| 91久久精品国产一区二区成人| aaaaa片日本免费| 老女人水多毛片| 国产精品国产高清国产av| 此物有八面人人有两片| 免费看a级黄色片| 久久热精品热| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产精品女同一区二区软件| 久久国内精品自在自线图片| 国产单亲对白刺激| 一本精品99久久精品77| 联通29元200g的流量卡| 欧美人与善性xxx| 亚洲中文字幕日韩| 国产 一区精品| 97超视频在线观看视频| 国产高清有码在线观看视频| 美女内射精品一级片tv| 亚洲精品久久国产高清桃花| 午夜爱爱视频在线播放| 欧美高清性xxxxhd video| 欧美日本视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| av天堂在线播放| 丰满人妻一区二区三区视频av| 日本免费a在线| 男人的好看免费观看在线视频| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 国产伦精品一区二区三区四那| 99精品在免费线老司机午夜| .国产精品久久| 成人毛片a级毛片在线播放| 村上凉子中文字幕在线| 国产精品,欧美在线| 色播亚洲综合网| 男人狂女人下面高潮的视频| 久久精品夜色国产| 真实男女啪啪啪动态图| 特级一级黄色大片| 九九在线视频观看精品| 男女啪啪激烈高潮av片| 日本色播在线视频| 97在线视频观看| 午夜免费激情av| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产片特级美女逼逼视频| 韩国av在线不卡| 老司机影院成人| 精品无人区乱码1区二区| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲,欧美,日韩| 少妇高潮的动态图| 成人av一区二区三区在线看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 色哟哟·www| 亚洲七黄色美女视频| 久久九九热精品免费| 亚洲国产色片| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 亚洲av不卡在线观看| 午夜久久久久精精品| 国内精品一区二区在线观看| 国产精品一区二区性色av| 国产精品av视频在线免费观看| 中国国产av一级| videossex国产| 麻豆成人午夜福利视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲成人精品中文字幕电影| 色在线成人网| 国产亚洲91精品色在线| 美女内射精品一级片tv| 最近2019中文字幕mv第一页| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲最大成人手机在线| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 色哟哟哟哟哟哟| 91av网一区二区| 国产高清有码在线观看视频| 热99re8久久精品国产| 免费观看精品视频网站| 一个人看的www免费观看视频| 亚洲精品一区av在线观看| 精品久久国产蜜桃| 国产成人aa在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 五月伊人婷婷丁香| 国产精品一及| 精品国产三级普通话版| 五月伊人婷婷丁香| 美女免费视频网站| 国产三级中文精品| 伊人久久精品亚洲午夜| 日韩成人伦理影院| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 久久久a久久爽久久v久久| 欧美成人免费av一区二区三区| av卡一久久| 免费看美女性在线毛片视频| 欧美性猛交黑人性爽| 午夜a级毛片| 村上凉子中文字幕在线| h日本视频在线播放| 看免费成人av毛片| 99久久成人亚洲精品观看| 国产69精品久久久久777片| 最近2019中文字幕mv第一页| 免费在线观看成人毛片| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产乱人偷精品视频| 少妇高潮的动态图| 3wmmmm亚洲av在线观看| 观看美女的网站| 国产亚洲欧美98| 99精品在免费线老司机午夜| 身体一侧抽搐| 国产黄a三级三级三级人| 国模一区二区三区四区视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产久久久一区二区三区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 老司机影院成人| 黄色欧美视频在线观看| 熟女电影av网| 久久久久久久久久黄片| 日本欧美国产在线视频| 一级毛片aaaaaa免费看小| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 久久精品综合一区二区三区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 免费观看精品视频网站| 日本黄大片高清| 国产精品三级大全| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲三级黄色毛片| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 色吧在线观看| 一区二区三区免费毛片| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产伦精品一区二区三区四那| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国产av不卡久久| 色播亚洲综合网| 免费看av在线观看网站| 国内精品久久久久精免费| 欧美xxxx性猛交bbbb| 欧美3d第一页| 国产在视频线在精品| 欧美三级亚洲精品| 免费电影在线观看免费观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 国产高潮美女av| 色综合亚洲欧美另类图片| 性插视频无遮挡在线免费观看| 99久国产av精品| 亚洲av二区三区四区| 午夜a级毛片| 国产成人影院久久av| 啦啦啦韩国在线观看视频| 在线观看免费视频日本深夜| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 国产成人精品久久久久久| 久久中文看片网| 亚洲最大成人手机在线| 亚洲av成人精品一区久久| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲av.av天堂| 日本爱情动作片www.在线观看 | 亚洲色图av天堂| 高清午夜精品一区二区三区 | 成年女人毛片免费观看观看9| 免费看av在线观看网站| 成人av一区二区三区在线看| 免费看a级黄色片| 日本-黄色视频高清免费观看| 午夜福利视频1000在线观看| 欧美一区二区亚洲| 亚洲国产精品成人久久小说 | 午夜福利视频1000在线观看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲最大成人中文| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 看免费成人av毛片| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 我要搜黄色片| 精品一区二区三区视频在线| av专区在线播放| 我的老师免费观看完整版| 久久这里只有精品中国| 18禁在线播放成人免费| 久久99热6这里只有精品| 国产成人a区在线观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产精品av视频在线免费观看| 最近手机中文字幕大全| 亚洲久久久久久中文字幕| 黄色日韩在线| 久久中文看片网| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 精品一区二区三区视频在线| 青春草视频在线免费观看| 嫩草影视91久久| av免费在线看不卡| 亚洲四区av| 天堂影院成人在线观看| 国产黄片美女视频| 国产成人91sexporn| 欧美一区二区国产精品久久精品| 六月丁香七月| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲中文日韩欧美视频| 免费在线观看影片大全网站| 国产私拍福利视频在线观看| 国产真实乱freesex| 又爽又黄a免费视频| 精品福利观看| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲四区av| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产高清不卡午夜福利| 国产欧美日韩精品亚洲av| 最后的刺客免费高清国语| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 日本熟妇午夜| 亚洲欧美日韩无卡精品| 天堂√8在线中文| 身体一侧抽搐| 国产私拍福利视频在线观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 成人av在线播放网站| 一本精品99久久精品77| 亚洲专区国产一区二区| 久久精品影院6| 国产真实乱freesex| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产午夜福利久久久久久| 国产亚洲91精品色在线| 国产欧美日韩一区二区精品| 免费看日本二区| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲色图av天堂| 久久99热这里只有精品18| 国模一区二区三区四区视频| 老司机福利观看| 国产av在哪里看| 亚洲va在线va天堂va国产| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲色图av天堂| 国产精品无大码| 国产高清视频在线观看网站| 一边摸一边抽搐一进一小说| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲精品色激情综合| 在线免费十八禁| 少妇的逼水好多| 国产真实伦视频高清在线观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 精品久久久久久成人av| 精品不卡国产一区二区三区| 深夜精品福利| 秋霞在线观看毛片| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 免费av毛片视频| 日韩亚洲欧美综合| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 村上凉子中文字幕在线| 99久久精品国产国产毛片| 午夜视频国产福利| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 淫秽高清视频在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美激情久久久久久爽电影| 色吧在线观看| 久久久久性生活片| 国产成人freesex在线 | 国产成人影院久久av| 看黄色毛片网站| 在线观看一区二区三区| 欧美在线一区亚洲| 久久精品国产亚洲av天美| 日韩一本色道免费dvd| 欧美一区二区亚洲| 99热这里只有是精品50| 国产精品一区二区性色av| 亚洲精品国产成人久久av| 久久人人爽人人片av| 国产成人一区二区在线| 黄片wwwwww| 国产真实乱freesex| 国产午夜精品论理片| 久久99热这里只有精品18| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲人成网站高清观看| 波多野结衣高清无吗| 99国产精品一区二区蜜桃av| 成人综合一区亚洲| 亚洲美女黄片视频| 夜夜爽天天搞| 国产乱人偷精品视频| 久久热精品热| 国产成人影院久久av| 成人综合一区亚洲| 人人妻人人澡欧美一区二区| 精品久久久久久久末码| 美女被艹到高潮喷水动态| 亚洲成人精品中文字幕电影| av卡一久久| 赤兔流量卡办理| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 天美传媒精品一区二区| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲av二区三区四区| 九色成人免费人妻av| 午夜激情欧美在线| 18+在线观看网站| www.色视频.com| 男人狂女人下面高潮的视频| 色综合色国产| 九色成人免费人妻av| 亚洲av不卡在线观看| 最好的美女福利视频网| 天天躁日日操中文字幕| 日韩欧美在线乱码| 久久久久久久久大av| 精品久久久久久成人av| 男人舔奶头视频| 一本一本综合久久| 国产高清不卡午夜福利| 国产黄色小视频在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 99热网站在线观看| 女人被狂操c到高潮| 国产高潮美女av| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产毛片a区久久久久| 久久久精品欧美日韩精品| 成人一区二区视频在线观看| 久久99热这里只有精品18| 久久久国产成人精品二区| 日韩欧美 国产精品| 禁无遮挡网站| 国产黄片美女视频| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 欧美精品国产亚洲| 丝袜喷水一区| 日韩制服骚丝袜av| 欧美高清性xxxxhd video| 久久久久久久久大av| 可以在线观看毛片的网站| 日韩强制内射视频| 看黄色毛片网站| 三级国产精品欧美在线观看| 成人无遮挡网站| 少妇高潮的动态图| 亚洲五月天丁香| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 校园人妻丝袜中文字幕| 赤兔流量卡办理| 天堂动漫精品| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲不卡免费看| 日日撸夜夜添| 中文字幕免费在线视频6| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲人成网站在线播| 国产 一区精品| 中出人妻视频一区二区| 最好的美女福利视频网| 99热全是精品| 久久久午夜欧美精品| 久久精品夜色国产| 日韩欧美 国产精品| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 成人特级黄色片久久久久久久| 成人无遮挡网站| av.在线天堂| 亚洲欧美清纯卡通| 久久鲁丝午夜福利片| 国产精品三级大全| 精品久久久久久久久久久久久| ponron亚洲| 国产精品久久视频播放| 中文字幕av在线有码专区| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产精品亚洲一级av第二区| 免费大片18禁| 精品一区二区三区av网在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久国产乱子免费精品| 乱系列少妇在线播放| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 日本欧美国产在线视频| 欧美最新免费一区二区三区| 日韩av在线大香蕉| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 亚洲国产高清在线一区二区三| videossex国产| 亚洲av二区三区四区| 两个人视频免费观看高清| 伊人久久精品亚洲午夜| av在线天堂中文字幕| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 免费人成在线观看视频色| 国产精品一及| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 三级毛片av免费| 波多野结衣高清无吗| 亚洲成人久久爱视频| 欧美三级亚洲精品| 给我免费播放毛片高清在线观看| 欧美区成人在线视频| videossex国产| 熟女电影av网| 最近手机中文字幕大全| 一级黄色大片毛片| 久久久久九九精品影院| 成人亚洲欧美一区二区av| 我要看日韩黄色一级片| 国产 一区 欧美 日韩| 欧美bdsm另类| 精品无人区乱码1区二区| 免费观看在线日韩| 日本a在线网址| 成人欧美大片| 久久亚洲精品不卡| 最近2019中文字幕mv第一页| av天堂中文字幕网| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲av中文av极速乱| 俺也久久电影网| 青春草视频在线免费观看| 一区福利在线观看| 国产精品永久免费网站| 免费av毛片视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久久成人免费电影| 国产 一区 欧美 日韩| 日本一本二区三区精品| 久久国产乱子免费精品| 国产精品久久久久久久久免| 国产一区二区在线观看日韩| 九九爱精品视频在线观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产久久久一区二区三区| 亚州av有码| 少妇的逼水好多| 嫩草影院新地址| 欧美日韩综合久久久久久| 老司机影院成人| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产精品久久电影中文字幕| 美女黄网站色视频| 看黄色毛片网站| 综合色丁香网| 黄色一级大片看看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 亚洲在线自拍视频| av国产免费在线观看| 在线看三级毛片| 身体一侧抽搐| 久久久久国内视频| 免费无遮挡裸体视频| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲国产精品国产精品| 黄片wwwwww| 国产精品伦人一区二区| 亚洲精品一区av在线观看| 秋霞在线观看毛片| 欧美日本亚洲视频在线播放| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲成人中文字幕在线播放| 免费看日本二区| www日本黄色视频网| 国产精品永久免费网站| 色综合亚洲欧美另类图片| 一本精品99久久精品77| 五月玫瑰六月丁香| 免费观看精品视频网站| 亚洲精品粉嫩美女一区| 日韩欧美在线乱码| 黄色视频,在线免费观看| 尾随美女入室| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产精品国产高清国产av| 六月丁香七月| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看|