替莫唑胺對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物活性的影響

王建文 陳治標(biāo) 吳津成湖北荊州中心醫(yī)院泌尿外科 荊州 434020 2）武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)外科 武漢 430000

替莫唑胺對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物活性的影響

王建文1）陳治標(biāo)2）△吳津成1）
1）湖北荊州中心醫(yī)院泌尿外科 荊州 434020 2）武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)外科 武漢 430000

目的 探討替莫唑胺（Temozolomide，TMZ）及其衍生物對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物活性的影響，為人腦膠質(zhì)瘤的治療提供理論指導(dǎo)。方法 制備TMZ衍生物2-替莫唑胺-8-羧酸聚乙二醇脂（2T-P400、2T-P600），觀察不同濃度TMZ及其衍生物在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG-44體外抑瘤中的作用。結(jié)果 隨著終濃度的上升，TMZ、PEG400、PEG600對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率呈上升趨勢(shì)，相同終濃度TMZ對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率均顯著高于PEG400及PEG600（P＜0.05）；隨著終濃度的上升，2T-P400、2T-P600對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率呈上升趨勢(shì)，相同終濃度2T-P400與2T-P600對(duì)細(xì)胞體外生長(zhǎng)的抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；2T-P400、2T-P600的IC50略高于TMZ，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），PEG400、PEG600的IC50均顯著高于其他3種藥物。結(jié)論 TMZ能夠顯著降低人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物活性，其衍生物2T-P400、2T-P600具有相似的抑瘤效應(yīng)和更高的水溶性，為降低患者治療過(guò)程中胃腸道不良反應(yīng)、延長(zhǎng)其生存預(yù)期提供了方向。

腦膠質(zhì)瘤；替莫唑胺；細(xì)胞；生物活性

腦膠質(zhì)瘤全稱(chēng)為腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤，是一種顱內(nèi)腫瘤，良性腦膠質(zhì)瘤患者病程長(zhǎng)、癥狀不明顯，而惡性腦膠質(zhì)瘤患者瘤體生長(zhǎng)快、進(jìn)展迅速，病死率極高［1］。替莫唑胺（Temozolomide，TMZ）是一種化療藥物，對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞繁殖有良好的抑制作用，但其水溶性較低，使單次注射濃度受到影響，導(dǎo)致療效有所減弱［2］。而TMZ衍生物2-替莫唑胺-8-羧酸聚乙二醇脂（2T-P400、2T-P600）具有較高的穩(wěn)定性和水溶性，有望在腦膠質(zhì)瘤的治療中加以應(yīng)用。為探討其對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物活性的影響，筆者進(jìn)行了相關(guān)研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選取本實(shí)驗(yàn)室自行建系培養(yǎng)的人腦膠質(zhì)瘤體外細(xì)胞系SHG-44，主要試劑及設(shè)備包括：DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Invitrogen公司）、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（大連百奧思科生物科技有限公司）、二甲基亞砜（DMSO，北京市化學(xué)試劑廠）、小牛血清（上海怡成生物科技有限公司）、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，美國(guó)Sigma公司）、胰蛋白酶（德國(guó)Merck公司）、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（法國(guó)Joual公司）、超凈工作臺(tái)（上海博迅實(shí)業(yè)公司）、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)操作

1.2.1 TMZ衍生物制備：將1分子水溶性高分子聚合物PEG400或PEG600（天津天士力藥物研究院）與2分子TMZ聚合，在縮水劑作用下，脫水縮合即可形成2T-P400或2TP600，使用聚乙二醇調(diào)整2T-P400、2T-P600水溶性至合適范圍后［3］，使用60Co滅菌照射，-70℃保存待用。

1.2.2 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)：將SHG-44細(xì)胞解凍復(fù)蘇，置于DMEM培養(yǎng)液中，并在室溫、5％CO2環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔1d換液1次，每隔3d使用EDTA-胰蛋白酶進(jìn)行消化、傳代培養(yǎng)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：將SHG-44人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系接種至96孔板內(nèi)（1×104個(gè)/mL，100μL），分為6組，分別為T(mén)MZ組、2T-P400組、2T-P600組、PEG400組、PEG600組及空白對(duì)照組，使用MTT比色法，比較各組各孔570nm處吸光度（OD）值，并計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率［4］=（空白對(duì)照組OD值-待測(cè)組OD值）/空白對(duì)照組OD值×100％。

1.3.2 半數(shù)抑制濃度：采用改良窛氏法對(duì)藥物半數(shù)抑制濃度（lgIC50）進(jìn)行計(jì)算，lgIC50=Xm-I（P-（3-Pm-Pn）/4），其中Xm=1g最大劑量，I=最大劑量/相鄰劑量，P=陽(yáng)性反應(yīng)率之和，Pm=最大陽(yáng)性反應(yīng)率，Pn=最小陽(yáng)性反應(yīng)率。生物活性影響的判斷參照文獻(xiàn)［5］：若IC50≤10μg/mL視為具有明顯體外殺傷活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TMZ、PEG400、PEG600對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率 隨著終濃度的上升，TMZ、PEG400、PEG600對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率呈上升趨勢(shì)，相同終濃度TMZ對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率均顯著高于PEG400及PEG600（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 不同終濃度TMZ、PEG400、PEG600對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外生長(zhǎng)的抑制率 （％，±s）

表1 不同終濃度TMZ、PEG400、PEG600對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外生長(zhǎng)的抑制率 （％，±s）

注：與TMZ比較，aP＜0.05

藥物 終濃度（μmol/L）10 25 50 100 200 TMZ 21.87±0.62 29.41±2.36 47.01±4.92 67.94±1.87 80.03±1.59 PEG400 1.23±0.48a1.17±0.23a4.36±2.98a4.74±2.59a9.03±1.74aPEG600 1.87±0.92a2.46±0.53a4.58±1.74a5.46±0.87a6.55±2.10a

2.2 2T-P400、2T-P600對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率 隨著終濃度的上升，2T-P400、2T-P600對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率呈上升趨勢(shì)，相同終濃度2T-P400與2T-P600對(duì)細(xì)胞體外生長(zhǎng)的抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 不同終濃度2T-P400、2T-P600對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外生長(zhǎng)的抑制率 （％，±s）

表2 不同終濃度2T-P400、2T-P600對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外生長(zhǎng)的抑制率 （％，±s）

藥物 終濃度（μmol/L）5 12.5 25 50 100 2T-P400 17.53±2.72 23.91±5.02 36.29±0.85 55.74±0.97 70.12±0.59 2T-P600 15.53±1.86 22.94±4.79 35.84±0.87 51.55±0.48 69.52±0.37

2.3 半數(shù)抑制濃度 2T-P400、2T-P600的IC50略高于TMZ，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），PEG400、PEG600的IC50均顯著高于其他3種藥物。見(jiàn)表3。

表3 各藥物對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞半數(shù)抑制濃度比較 （μg/mL，±s）

表3 各藥物對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞半數(shù)抑制濃度比較 （μg/mL，±s）

藥物IC50 TMZ 9.89±0.35 2T-P400 12.7±0.29 2T-P600 15.5±0.27 PEG400 169.2±2.97 PEG600 175.3±6.43

3 討論

腦膠質(zhì)瘤占顱內(nèi)腫瘤發(fā)病率的45％以上，惡性腦膠質(zhì)瘤世界范圍內(nèi)35歲以下病死率居第2位，多數(shù)患者在患病6個(gè)月內(nèi)即出現(xiàn)嚴(yán)重癥狀，且術(shù)后復(fù)發(fā)率較高［6］，因此，有效的治療藥物合成是臨床研究的重點(diǎn)。TMZ在近年來(lái)腦膠質(zhì)瘤的治療中得到廣泛應(yīng)用，其作用機(jī)制明確、血腦屏障通過(guò)率高等優(yōu)勢(shì)使得患者生存預(yù)期得到明顯延長(zhǎng)，但TMZ可導(dǎo)致明顯胃腸道反應(yīng)，影響患者依從性。有學(xué)者提出使用TMZ衍生物靜脈給藥方案，而TMZ較低的水溶性為高濃度注射劑的開(kāi)發(fā)造成了較大阻礙［7］。

大量實(shí)驗(yàn)已證明，TMZ 8-位取代衍生物具有良好的抑瘤效應(yīng)，而TMZ-8-羧酸在縮合劑作用下可與PEG的羧基脫水縮合，從而使TMZ具有水溶性。為探討TMZ及其衍生物的體外抑瘤效果，筆者對(duì)TMZ及其衍生物在SGH-44人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制中的作用進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)隨著終濃度的上升，TMZ、PEG400、PEG600對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率呈上升趨勢(shì)，相同終濃度TMZ對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率均顯著高于PEG400及PEG600（P＜0.05），且隨著終濃度的上升，2T-P400、2T-P600對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率呈上升趨勢(shì)，相同終濃度2T-P400與2T-P600對(duì)細(xì)胞體外生長(zhǎng)的抑制率無(wú)明顯差異（P＞0.05）；在IC50的分析中，我們發(fā)現(xiàn)2T-P400、2TP600的IC50略高于TMZ，但無(wú)明顯差異（P＞0.05），PEG400、PEG600的IC50均顯著高于其他3種藥物。說(shuō)明TMZ、2T-P400及2T-P600均具有良好的抑瘤效應(yīng)，能夠顯著降低人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物活性。TMZ是2代咪唑四嗪衍生物，其抑瘤效應(yīng)主要借助TMZ細(xì)胞毒性導(dǎo)致的DNA甲基化和錯(cuò)配修復(fù)失敗，在口服TMZ后，患者內(nèi)源性血管生成抑素水平顯著上升［8］，使得新生腫瘤血管形成受到阻礙，且促進(jìn)了腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，作為一類(lèi)TMZ衍生物，2TP400及2T-P600亦具有相同的抑瘤機(jī)制，且在合成中，通過(guò)改變PEG的分子量能夠良好地控制其水溶性，同時(shí)，研究可見(jiàn)，PEG對(duì)腦膠質(zhì)瘤組織的抑制作用不明顯，其與TMZ結(jié)合并不會(huì)影響療效，因此，我們認(rèn)為，TMZ衍生物較TMZ具有更明顯的優(yōu)勢(shì)，亦具有更佳的應(yīng)用前景。2T-P400、2TP600良好的水溶性和穩(wěn)定性使得將TMZ類(lèi)藥物制成高濃度注射劑，有助于多渠道給藥，以降低胃腸道不良反應(yīng)的發(fā)生率，改善患者治療體驗(yàn)［9］；TMZ類(lèi)藥物水溶性的提高，有望促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤腰椎穿刺蛛網(wǎng)膜下腔局部給藥的實(shí)施，從而避開(kāi)血腦屏障，有助于抑制腦膠質(zhì)瘤的全身擴(kuò)散，提高患者生存預(yù)期［10］。需要指出的是，本研究全部實(shí)驗(yàn)均在體外進(jìn)行，與體內(nèi)環(huán)境存在一定差異，因此，TMZ衍生物對(duì)人腦膠質(zhì)瘤的體內(nèi)治療效果仍有待進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究和改進(jìn)。

綜上所述，TMZ能夠顯著降低人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物活性，其衍生物2T-P400、2T-P600具有相似的抑瘤效應(yīng)和更高的水溶性，為降低患者治療過(guò)程中胃腸道不良反應(yīng)、延長(zhǎng)其生存預(yù)期提供了研究方向。

［1］Warren KE，Gururangan S，Geyer JR，et al.A phaseⅡstudy of O6-benzylguanine and temozolomide in pediatric patients with recurrent or progressive high-grade gliomas and brainstem gliomas：a Pediatric Brain Tumor Consortium study［J］.J Neurooncol，2012，106（3）：643-649.

［2］孫爽，李鴻彬.替莫唑胺治療腦轉(zhuǎn)移瘤研究進(jìn)展［J］.人民軍醫(yī)，2011，54（3）：235-236.

［3］肖勇輝，鄭志堅(jiān)，曾黃輝.替莫唑胺聯(lián)合放療治療腦轉(zhuǎn)移瘤的臨床研究［J］.腫瘤藥學(xué)，2013，3（2）：122-125.

［4］Blough MD，Beauchamp DC，Westgate MR，et al.Effect of aberrant p53function on temozolomide sensitivity of glioma cell lines and brain tumor initiating cells from glioblastoma［J］.J Neurooncol，2011，102（1）：1-7.

［5］魏磊.三維適形放療聯(lián)合替莫唑胺治療在腦膠質(zhì)瘤術(shù)后應(yīng)用的效果觀察［J］.中國(guó)醫(yī)藥指南，2012，10（27）：196-197.

［6］Lee EQ，Puduvalli VK，Reid JM，et al.Phase I study of vorinostat in combination with temozolomide in patients with highgrade gliomas：North American brain tumor consortium study 04-03［J］.Clin Cancer Res，2012，18（21）：6 032-6 039.

［7］陳云鵬，張弩，丁之明，等.敲低Aurora A基因增強(qiáng)替莫唑胺抗人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的作用［J］.中國(guó)神經(jīng)精神疾病雜志，2012，38（5）：284-288.

［8］Albanese C，Alzani R，Amboldi N，et al.Anti-tumour efficacy on glioma models of PHA-848125，a multi-kinase inhibitor able to cross the blood-brain barrier［J］.Br J Pharmacol，2013，169（1）：156-166.

［9］唐東方，董軍，黃強(qiáng)，等.替莫唑胺衍生物治療人腦膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)微侵襲神經(jīng)外科雜志，2012，17（3）：124-126.

［10］Chen J，Li Y，Yu TS，et al.A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy［J］.Nature，2012，488（7 412）：522-526.

（收稿2014-08-10）

R730.264

A

1673-5110（2015）11-0035-03

△通訊作者：陳治標(biāo)，博士，主任醫(yī)師，研究方向：神經(jīng)外科學(xué)，E-mail：chenzbiaoh@126.com