一株產(chǎn)漆酶菌株的分離及對造紙廢水的處理研究

慎鏞健，徐 昌，李 穎，李秀媛(.大慶市環(huán)境監(jiān)測中心站，黑龍江大慶6336;.大慶市輻射環(huán)境監(jiān)督站，黑龍江大慶6336)

漆酶(EC 1.10.3.2)是一種含銅離子的多酚氧化酶，自1883年日本學(xué)者 Yoshida首次發(fā)現(xiàn)漆酶以來［1－3］，漆酶一直是化學(xué)、生物學(xué)以及環(huán)境科學(xué)研究的熱點(diǎn)問題［4］。目前，已發(fā)現(xiàn)漆酶廣泛分布于自然界，己在高等植物、真菌、昆蟲以及細(xì)菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，很多漆酶來自植物和真菌以及少量的細(xì)菌［5－8］?？莶菅挎邨U菌是一種研究較多的細(xì)菌，其熱穩(wěn)定性較好，但是關(guān)于其報道較少［9－11］。筆者從大慶林甸海達(dá)紙業(yè)公司造紙廠活性污泥中分離得到了一株活性漆酶細(xì)菌菌株WG35，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性研究以及16S rDNA序列分析對其進(jìn)行鑒定，并將該菌株應(yīng)用于造紙廢水的處理。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑 試驗樣品來自大慶林甸海達(dá)紙業(yè)公司造紙廠活性污泥。主要試劑包括丁香醛連氮(Sigma公司)、質(zhì)粒提取試劑盒(Omega公司)、膠回收試劑盒(Omega公司)、rTaq酶(TaKaRa公司)、pMD18-T 載體(TaKaRa公司)、Escherichia coli JM109感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa公司)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 產(chǎn)漆酶菌種篩選。在無菌條件下，將20 g活性污泥樣品加入到滅菌的液體LB培養(yǎng)基內(nèi)。在37℃下振蕩培養(yǎng)36 h后，進(jìn)行梯度稀釋。然后，在LB固體平板后涂布，37℃培養(yǎng)6 d后，取含有單菌落平板，菌落周圍滴加丁香醛連氮，純化菌種。

1.2.2 菌株鑒定。

1.2.2.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定。菌株進(jìn)行培養(yǎng)后，按照文獻(xiàn)［10］中的方法進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定:①觀察菌體、菌落特征;②依次進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色、鞭毛染色等試驗。

1.2.2.2 菌株的生理生化鑒定。對篩選到的菌株，根據(jù)16S rRNA序列同源性分析與細(xì)菌系統(tǒng)分類鑒定中的方法進(jìn)行生理生化鑒定，包括氧化酶試驗、過氧化氫酶試驗、甲基紅(M.R)試驗、V.P試驗、糖或醇類發(fā)酵試驗、硝酸鹽還原試驗、產(chǎn)生吲哚試驗、硫化氫試驗、檸檬酸鹽或丙酸鹽的利用試驗、丙二酸鹽利用試驗、酪氨酸水解試驗、馬尿酸鹽水解試驗、對疊氮化鈉抗性試驗、對溶菌酶抗性試驗、好氧性試驗、明膠液化試驗、淀粉水解試驗，并根據(jù)試驗結(jié)果對照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》。

1.2.2.3 菌株的16S rDNA鑒定。菌株的16S rDNA鑒定包括基因組DNA的提取、16S rDNA序列的擴(kuò)增(采用基因組DNA為模板，擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測)、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化與連接、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化與驗證、16S rDNA測序與序列分析。

1.2.3 漆酶對造紙黑液的處理研究。造紙黑液取自大慶海達(dá)紙業(yè)有限公司。取造紙黑液100 ml，以丁香醛(syringaldehyde，SYR)作為降解體系介體。調(diào)節(jié)介體濃度為0.1 mmol/L，在40℃、pH=8.0條件下，往造紙黑液中加入篩選菌株所產(chǎn)漆酶的粗提液2%，并作用3 d。用COD和BOD儀分別測定經(jīng)漆酶處理第2天和第3天造紙黑液中BOD/COD比值，考察生化可降解率變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)漆酶細(xì)菌的篩選與鑒定

2.1.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定。將樣品通過含Cu2+培養(yǎng)基富集后，利用在菌落中央及邊緣滴加漆酶底物SGZ再從污泥中分離的細(xì)菌中篩選出一株可在氧化丁香醛連氮變紅的細(xì)菌，將其編號為WG35。WG35菌株革蘭氏染色呈陽性，有莢膜及鞭毛，菌落不透明。由圖1和圖2可知，菌體大小約為0.4～0.6 μm ×1.0 ～2.5 μm，芽孢呈橢圓形，大小約為0.8 μm ×1～2 μm。

2.1.2 菌株的生理生化鑒定。由表1可知，菌株WG35的氧化酶反應(yīng)、過氧化氫酶反應(yīng)陽性;V.P反應(yīng)陽性;好氧性試驗結(jié)果呈陽性;硝酸鹽還原反應(yīng)陽性;能夠分解淀粉、酪氨酸;能夠液化明膠;能夠利用果糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、肌醇、檸檬酸鹽;M.R反應(yīng)陰性;不能利用丙二酸鹽、丙酸鹽、阿拉伯糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖;不能水解馬尿酸鹽;不能在0.02%疊氮化鈉內(nèi)生長;0.001%溶菌酶能生長。通過生理生化特征和形態(tài)學(xué)鑒定，初步鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌。

表1 菌株WG35的部分生理生化特征

2.1.3 菌株的16S rDNA鑒定。圖3為菌株WG35基因組DNA電泳圖，對菌株WG35基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小約1 500 bp的單一條帶(圖4)。經(jīng)T載體克隆后進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果表明，菌株WG35的16S rDNA序列擴(kuò)增片段長度為1 513 bp(圖5)。將測序所得序列在GenBank中進(jìn)行同源性比，結(jié)果表明，該序列與枯草芽孢桿菌的16S rDNA相似性最高，達(dá)到99%。

以相似性為基礎(chǔ)選取不同的芽孢桿菌的16S rDNA序列，采用MEGA 5.0軟件構(gòu)建菌株WG35的系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖5可知，WG35在系統(tǒng)發(fā)育樹上與Bacillus subtilis進(jìn)化距離較近，在系統(tǒng)發(fā)育樹上處于同一分支上。說明該菌株在分子系統(tǒng)發(fā)育分類學(xué)上屬于Bacillus subtilis。

2.2 漆酶對造紙廢水的降解結(jié)果 BOD/COD比值反映的是污水的可生化降解性。菌株WG35所產(chǎn)的漆酶粗提液加入造紙黑液后第2天和第3天，造紙黑液中BOD/COD比值分別為0.39和0.85?？梢姡尤肫崦负蟮?天的黑液可降解性比第2天增加了近1倍。經(jīng)漆酶處理后，造紙黑液的可生化性較好，有利于后續(xù)處理。

3 結(jié)語

漆酶從發(fā)現(xiàn)至今已有百余年的歷史了，漆酶在各方面的優(yōu)越性能使得人們對其關(guān)注度越來越高。漆酶來源廣泛，多種生物都能夠產(chǎn)生漆酶。雖然關(guān)于漆酶的研究已經(jīng)取得較大的進(jìn)展，但是但關(guān)于細(xì)菌漆酶報道的仍然很少。篩選得到的菌株WG35，經(jīng)鑒定屬枯草芽孢桿菌。細(xì)菌漆酶具有適應(yīng)pH范圍廣，易控制生長條件等優(yōu)點(diǎn)，且在異源表達(dá)和重組方面比真菌漆酶更具有優(yōu)勢。因此，基于細(xì)菌漆酶的生長特性，繼續(xù)深入地研究WG35菌株，探索其酶學(xué)性質(zhì)以及產(chǎn)酶機(jī)制具有很重要的意義。

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