一株高效慢生型花生根瘤菌的篩選

孫杉杉，朱瑞艷，杜迎輝，徐志文 (領(lǐng)先生物農(nóng)業(yè)股份有限公司，河北秦皇島066000)

花生是一年生豆科植物，有豐富的營養(yǎng)價值，富含維生素、蛋白質(zhì)和脂肪，是世界上種植面積最大的油料作物，在我國各地均有種植。作為我國主要的油、糧兩用作物，花生是營養(yǎng)比較全面的作物食品［1］。

花生根瘤菌能與花生形成共生根瘤，固定空氣中的氮氣，為植物生長提供營養(yǎng)，提高花生的產(chǎn)量和品質(zhì)，可使花生在貧瘠的土壤中生長。花生根瘤菌與花生通過有效的共生固氮作用可提供花生生育期有效氮素的50%［2］。因此，用高效固氮根瘤菌菌株制成的根瘤菌菌劑應(yīng)用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有效果好、成本低、不污染環(huán)境、增加土壤氮素、提高土壤肥力的作用［3］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基。固體和液體培養(yǎng)均使用YMA培養(yǎng)基，組成為:10 g甘露醇、0.8 g酵母浸膏粉、0.25 g 磷酸氫二鉀、0.25 g磷酸二氫鉀、0.2 g硫酸鎂、0.1 g氯化鈉、15～20 g瓊脂、1 000 ml蒸餾水，pH 6.8 ～7.0。

1.1.2 土樣。從山東、河北、河南、遼寧4個花生種植地區(qū)，取回20個土樣。

1.1.3 花生品種。供試品種為冀花4號

1.2 試驗方法

1.2.1 花生根瘤菌的捕捉。將10 g土壤樣與90 g無菌水加到三角瓶中，振蕩搖勻，得到10-1稀釋度的土壤懸液;取10 ml土壤懸液，加90 ml無菌水，振蕩搖勻，得到10-2稀釋度的土壤懸液;按照同樣方式，制備得到10-3、10-4、10-5稀釋度的土壤懸液。

將1 ml上述土壤懸液接種到花盆中(花生種子已萌芽)，在花盆中以蛭石為培養(yǎng)介質(zhì)對花生種子進行培養(yǎng)，定期澆灌常規(guī)低氮培養(yǎng)液。在培養(yǎng)1～2個月后，收獲的植物均有根瘤［4］。

1.2.2 根瘤菌的分離、純化。

1.2.2.1 分離。將根瘤洗凈，用剪刀剪下，帶點根，選取個大、粉紅的，分別按編號放入離心管中，加濃度95%乙醇浸泡30 s，以消除表面張力，倒出后直接加濃度0.2%的氯化汞消毒2～5 min，然后用無菌水沖洗五六次，用無菌不銹鋼釬子搗碎，用接種環(huán)蘸取汁液劃線接種于斜面試管，重復(fù)1次。

1.2.2.2 純化。先準備好帶玻璃珠加水的無菌試管或離心管一支，從試管長出的菌落上挑取一環(huán)于管內(nèi)水中，振蕩1 min制成均勻、分散的菌懸液，取一環(huán)在YMA培養(yǎng)皿上劃線接種，重復(fù)1次，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，3 d后觀察菌落生長情況，如不純，按上法反復(fù)純化［4］。

1.2.3 根瘤菌的回接結(jié)瘤試驗。將之前純化好的菌種用YMA培養(yǎng)基培養(yǎng)，制成發(fā)酵液備用。將蛭石裝入小花盆中，加入低氮培養(yǎng)液至飽和，高壓滅菌。將事先萌芽好的健康、芽長一致的花生種子栽入花盆中，在種子周圍加入事先培養(yǎng)好的發(fā)酵液1 ml。種植1～2個月后觀察。

1.2.4 根瘤菌的鑒定。樣品總DNA的制備按常規(guī)的細菌DNA提取方法進行。PCR引物有正向引物27F，反向引物1492R。PCR反應(yīng)體系20 μl，反應(yīng)液組成為:1 μl DNA模板，10 μl 2 ×MastarMix，0.4 μl 27F ，0.4 μl 1492R，超純水補足至20 μl。PCR擴增程序為:95℃ 2 min;30個循環(huán)(84℃ 1 min，52℃ 1 min，65 ℃ 8 min);65 ℃ 18 min。

擴增產(chǎn)物經(jīng)濃度0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送北京三博遠志公司測序。將測到的DNA序列進行人工矯正后，使用NCBI中的BIAST軟件在線比對。經(jīng)比對，所鑒定的9個菌株與大豆根瘤菌的相似度為99%。所以，斷定這9個菌株均為根瘤菌屬。在回接試驗中，與花生有較好的結(jié)瘤效果，于是可以確定它們?yōu)榛ㄉ鼍?/p>

1.2.5 盆栽試驗?；ㄉ砻嫦竞蟠哐?～10 d;制備各個試驗菌株的發(fā)酵液;選取芽長一致的花生種子，在發(fā)酵液中浸泡10 min后移入裝有蛭石的花盆(13×15 cm)中培養(yǎng);每盆留1株苗，一個菌株為1組，每組8個平行，另外設(shè)計以清水浸種的空白一組，對照菌株一組。定期澆水，調(diào)查，種植4個月以后收獲。

2 結(jié)果與分析

2.1 根瘤菌的捕捉、分離、純化 對20個土樣進行根瘤菌的捕捉、分離、純化，最終獲得20株野生型菌株。

2.2 根瘤菌的回接試驗 確定根瘤分離物是否為共生細菌的最好方法是回接試驗。只有在原宿主上回接結(jié)瘤，才能確定是哪種植物的根瘤菌。

將活的20株野生菌株分別與花生進行結(jié)瘤試驗。經(jīng)過近2個月的培養(yǎng)觀察，發(fā)現(xiàn)其中9個菌株與宿主花生有較好的結(jié)瘤效果，在不同程度地促進植物生長，而其他11個菌株結(jié)瘤效果較差，促生長效果不明顯，有些還會使作物根部變成褐色。因此，經(jīng)過初篩，初步確定有9個菌株為花生根瘤菌。

2.3 花生根瘤菌的16s rDNA鑒定和生理生化鑒定 經(jīng)過16s測序，與大豆根瘤菌基因的相似度達99%以上，為根瘤菌屬。結(jié)合回接試驗結(jié)果，可以確定該9株根瘤菌為花生根瘤菌。

將9個菌株分別接種在牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基中，在溫度28℃下培養(yǎng)5 d。如果培養(yǎng)液澄清，菌體未見生長，與未接種菌株的對照相同，那么表明該菌株不能在牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基上生長。將9個菌株分別在BTB平板上溫度28℃下培養(yǎng)7 d。如果平板顏色變藍，那么說明該菌株在BTB平板上產(chǎn)堿，屬于慢生型菌株。將9個菌株分別在石蕊牛奶培養(yǎng)基中28℃下培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)基顏色變藍，并且形成乳清環(huán)，表明該菌株產(chǎn)堿，屬于慢生型。3-酮基乳糖反應(yīng)呈陰性，菌落周圍未出現(xiàn)黃褐色沉淀，表明該菌株為非土壤桿菌。通過上述方法，判定所篩選的9個菌株均為慢生型花生根瘤菌。

2.4 花生根瘤菌盆栽試驗結(jié)果 分離的9株慢生型花生根瘤菌按采集地區(qū)分別命名為 ZMW、LX、XCW、XWW、YS、YSW、ZW、DMW、WDW。另取該公司公開銷售的一株花生根瘤菌株144，將上述10個菌株進行盆栽比較試驗。按照常規(guī)的調(diào)查方法，待花生植株生長到花期時，開始調(diào)查結(jié)瘤數(shù)、干重、全氮，培養(yǎng)約4個月時調(diào)查產(chǎn)量。

由表1～4可知，與對照相比，施用過花生根瘤菌WDW菌液的花生植株單株結(jié)瘤數(shù)提高925.6%，單株干重提高63.6%，單株全氮含量提高18.1%，單株產(chǎn)量提高57.9%。與現(xiàn)有生產(chǎn)使用的花生根瘤菌144相比，單株結(jié)瘤數(shù)提高27.4%，單株干重提高8.7%，單株全氮含量提高6.5%，單株產(chǎn)量提高30.45%。所選的花生根瘤菌菌株WDW能明顯提高結(jié)瘤量和產(chǎn)量，提高植物的固氮能力，有效促進植物的生長發(fā)育。

3 結(jié)論與討論

研究中，只對植株的結(jié)瘤數(shù)、干重、全氮和產(chǎn)量進行了調(diào)查，沒有對固氮酶活力進行研究。但是，有研究表明，結(jié)瘤數(shù)與固氮酶活性間也有一定的關(guān)系。張宏等［5-7］研究也闡述了這一規(guī)律。另外，根瘤菌存在一定的地域性［8-10］，所以在菌劑的開發(fā)和實際的應(yīng)用過程中要因地制宜。

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