柴胡組織培養(yǎng)外植體消毒條件的研究

劉茹，曹玲麗，劉霞，舒曉燕，侯大斌(西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽621010)

柴胡為臨床常用中藥，具有較高的經(jīng)濟價值。傘形科植物北柴胡(Bupleurum chinense DC.)或狹葉柴胡 Bupleurum scorzonerifolium Willd.)的干燥根是2010年版《中國藥典》一部收載的正品柴胡［1］。藥理研究表明柴胡具有解熱、抗病毒、降血脂、保肝、抗炎、抗腫瘤等作用［2－3］。柴胡化學成分復雜，主要含有皂苷、黃酮、揮發(fā)油、有機酸、多糖類等［4－5］。近幾年，藥材市場正面臨著藥用資源短缺的問題，柴胡的馴化栽培已經(jīng)存在，但長期栽培易導致柴胡品種退化、病害發(fā)生，從而導致柴胡產(chǎn)量和品質(zhì)下降。因此，脫毒培養(yǎng)獲得無毒苗很有必要，再大量繁殖可以恢復品種特性，以滿足生產(chǎn)需要。此外，利用外植體組織培養(yǎng)與超低溫條件可以長期保存，給離體保存的種植資源引種提供方便［6－8］。

組織培養(yǎng)中首先要解決且較難控制的問題是污染，如果不能將污染率降低到一定范圍內(nèi)，組織培養(yǎng)技術就失去了推廣的意義，工藝也難以進行下去。在自然條件下，作為外植體的植物材料，無論外部還是內(nèi)部都帶有很多細菌和霉菌。因此，探索外植體的最佳消毒條件是柴胡組織培養(yǎng)的關鍵，也為其進一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試材料為北柴胡新審定品系“川北柴1號”種子。“川北柴1號”系四川德培源公司選育，在四川多年多點品比試驗中具有良好適應性，該品系已在2014年通過品系審定。

1.2 試驗方法 將“川北柴1號”種子在流水下沖洗4 h，用70%乙醇浸泡50 s，無菌水沖洗3次后浸泡在消毒劑中進行消毒，無菌水沖洗至無明顯顏色出現(xiàn)為止。消毒試驗設計9個處理(表1)。用無菌濾紙吸干消毒處理后種子上的蒸餾水，接種到 MS+1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA 的誘導培養(yǎng)基中，每個處理接種10瓶，每瓶接種一個外植體，重復3次。培養(yǎng)14 d后統(tǒng)計其污染率和存活率。比較消毒效果，篩選最佳外植體消毒條件。

試驗所用培養(yǎng)基都以MS為基本培養(yǎng)基，以6 g/L瓊脂粉為固化劑，附加30 g蔗糖，pH在5.8～6.0。培養(yǎng)箱溫度在(25±1)℃。光照強度為2 000 lx。光照時間為14 h/d。

表1 不同消毒處理的試驗設計

計算公式:

污染率=(污染的柴胡種子數(shù)/接種的柴胡種子總數(shù))×100%

存活率=(存活的柴胡種子數(shù)/接種的柴胡種子總數(shù))×100%

2 結果與分析

2.1 不同消毒時間對柴胡外植體的消毒效果 由表2可知，25 g/L NaClO消毒處理柴胡種子5 min的效果最差，污染率為100%;100 g/L NaClO消毒處理柴胡種子30 min的消毒效果最好，污染率低至6.7%，存活率為86.7%。

用100 g/L NaClO消毒處理柴胡種子，不同時間外植體消毒效果見圖1。由圖1可知，隨著消毒時間的增加柴胡外植體污染率降低，最低為6.7%，成活率上升，最高86.7%。因此，消毒時間為30 min時消毒效果最佳。

表2 不同消毒條件對柴胡外植體的影響

2.2 不同濃度NaClO對柴胡外植體的消毒效果 選定30 min為最佳消毒時間，考察不同濃度NaClO的消毒效果，發(fā)現(xiàn)NaClO濃度為25 g/L時消毒效果最差，污染率達66.7%。NaClO濃度為100 g/L時消毒效果最好，污染率僅為6.7%，成活率為86.7%。為獲得更好的消毒效果，將Na-ClO濃度提高到200 g/L，發(fā)現(xiàn)其污染率升高，而外植體的存活率由86.7%降低為80%(圖2)。因此，消毒劑NaClO最佳消毒濃度為100 g/L。

方差分析表明，NaClO濃度對柴胡外植體消毒的污染率和存活率有極顯著影響(P＜0.01)。消毒時間對柴胡外植體消毒的污染率和存活率有顯著影響(P＜0.05)。

3 結論與討論

植物組織培養(yǎng)中的首個問題就是控制污染率，一般而言，污染率應控制在8%以內(nèi)，但在實際生產(chǎn)中污染率達20%，有時高達50%，甚至100%［9］。組織培養(yǎng)中消毒劑既要殺滅材料上的病菌，也要易被蒸餾水沖洗掉或自行分解，而且不會損傷或輕微損傷組織，影響其生長。因此，該研究選擇的消毒劑為NaClO，殺菌效果好，且易清除干凈。此外，消毒過程中要選擇合適的濃度和時間，低濃度的NaClO不能使外植體消毒徹底，高濃度又會破壞外植體的細胞，細胞處于自我保護，會產(chǎn)生大量的次生物質(zhì)，引起細胞毒害，導致外植體褐變甚至死亡。若消毒時間過長會對外植體造成一定程度損傷，產(chǎn)生次生代謝物，毒害細胞，使外植體死亡率增加;如果為了降低死亡率減少消毒時間，就會導致消毒不徹底，污染率升高。因此，消毒劑濃度和消毒時間對組織培養(yǎng)中滅菌過程有顯著影響。選擇合適的消毒劑和相對適宜的消毒時間成為“川北柴1號”組織培養(yǎng)中的關鍵。

該研究選用柴胡種子作為外植體進行組織培養(yǎng)研究，以期為推廣柴胡新品種“川北柴1號”尋求最佳繁殖模式。該試驗采用不同濃度的NaClO對柴胡種子進行消毒處理，得到“川北柴1號”組織培養(yǎng)中最佳外植體消毒條件:100 g/L Na-ClO處理柴胡種子30 min的消毒效果最好，污染率低至6.7%，成活率86.7%。王騰越等［10］研究了土沉香外植體的最佳消毒方法，污染率43.33%，成活率31.67%。李鍵等［11］研究了雷公藤外植體最佳消毒條件，污染率21.08%，成活率65.66%。林妃等［12］研究了花梨木外植體的最佳消毒方法，污染率40.0%，成活率51.4%。因此，相對于這些植物的消毒效果，柴胡組織培養(yǎng)中污染率可以得到控制。這可能是因為該試驗選擇的外植體為柴胡種子，本身體積小，攜帶的細菌少且消毒劑的危害不大。因為組織培養(yǎng)中污染率不僅與消毒劑的濃度及消毒時間有關，也可能是由于接種過程中培養(yǎng)材料被污染或是培養(yǎng)過程中環(huán)境的溫度、濕度不合適造成的。所以在組織培養(yǎng)接種過程中要注意工作臺面的干凈，使用鑷子等工具要預先進行乙醇消毒;也要選擇濕度、溫度都適宜且病菌少的環(huán)境。此外，組織培養(yǎng)中的存活率不僅與消毒劑及消毒時間有關，也可能是材料本身相對老化或者是培養(yǎng)基激素影響。因此，要保證組織培養(yǎng)中材料低污染率高存活率，除選擇最佳的消毒處理，也須選擇合適的外植體、適宜的生長激素和環(huán)境。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:263－264.

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［11］李鍵，李建鵑，吳承禎.等.雷公藤組織培養(yǎng)外植體消毒和選擇［J］.中南林業(yè)科技大學學報，2010，30(8):18 －21.

［12］林妃，李敬陽，常勝合，等.花梨木組織培養(yǎng)外植體消毒方法初步探討［J］.基因組學與應用生物學，2013，32(4):522 －525.