黃樹莓離體培養(yǎng)及脫毒技術研究

田新華，翁海龍，曹焱，郭樹平(黑龍江省林業(yè)科學研究所，黑龍江哈爾濱150081)

黃樹莓果實營養(yǎng)豐富，含有多種維生素、氨基酸和礦質(zhì)元素、鞣化酸、超氧化物岐化酶(SOD)等特殊生理活性物質(zhì)［1－2］。果實鮮黃，氣味芳香，入口先酸后甜，深受歐美等國歡迎，既可鮮食果品，又可加工成果汁、罐頭等多種食品。同時黃樹莓葉片提取物粗黃酮是一種良好的天然抗氧化劑，具有降血糖、降血脂、抗氧化高效性與低毒性等生理活性［3］。

然而植株受病毒感染積累，導致葉片黃化、產(chǎn)量下降，果實品質(zhì)變劣且可遺傳給后代，給生產(chǎn)造成重大的經(jīng)濟損失，嚴重影響了黃樹莓優(yōu)良品種的推廣。

國外采用組織培養(yǎng)方法進行苗木的脫毒快繁［4］，既可保持植物的優(yōu)良特性和性狀，又防止品種過快退化，生產(chǎn)上己實現(xiàn)了無毒苗良種化［5］。目前，黃樹莓優(yōu)質(zhì)苗木的快速生產(chǎn)與無毒苗的大力推廣己成為制約我國黃樹莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸因素。因此，筆者對引進優(yōu)質(zhì)黃樹莓品種展開組培脫毒快繁技術研究，旨在提出一套完整的苗木脫毒培養(yǎng)技術體系，為無毒苗木的生產(chǎn)提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理 供試材料為黑龍江省園藝分院引進的美國黃樹莓，采集一年生枝條為外植體，用刀片切去葉片及部分葉柄，先用洗滌劑清洗一遍，然后流水沖洗30 min，剪取長1.0～2.0 cm的帶芽莖段，在超凈工作臺上用0.1%氯化汞溶液表面滅菌，滅菌時間分別為4、6、8 min 3種處理，滅菌后用無菌水沖洗3次，并于無菌水中浸泡40～60 min后取出用無菌濾紙吸干材料表面多余水分，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 誘導側芽萌發(fā)。剪去莖段兩端多余部分后，在無菌條件下將單芽莖段接種于MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L+GA30.5 mg/L培養(yǎng)基中，誘導側芽萌發(fā)生長。

1.2.2 正交試驗設計篩選芽增殖培養(yǎng)基。待莖段腋芽伸長后，分別轉接于以MS為基本培養(yǎng)基，以6-芐基腺嘌呤(6-BA)、赤霉素(GA3)、萘乙酸(NAA)為3個因素，每因素設置3個水平，采用正交試驗設計L9(34)進行芽增殖培養(yǎng)基篩選(表1)。每個處理2次重復，每個重復接種10瓶，培養(yǎng)35 d后調(diào)查結果。

1.2.3 單因素試驗設計篩選生根培養(yǎng)基。剪取苗高1.5～2.0 cm的單芽莖段，分別轉接于以下5種生根培養(yǎng)基:①1/2MS+IBA 0.2 mg/L;②1/2MS+IBA 0.4 mg/L;③1/2MS+NAA 0.2 mg/L;④1/2MS+NAA 0.4 mg/L;⑤1/2MS+IBA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L中進行試管苗生根培養(yǎng)，培養(yǎng)30 d后調(diào)查結果。每個處理2次重復，每個重復接種10瓶。上述培養(yǎng)基均加蔗糖30 g/L，日產(chǎn)瓊脂粉6 g/L，pH調(diào)至5.8。

以上培養(yǎng)條件均為:白天溫度(25±1)℃，夜間溫度(20±1)℃，光照強度2 000 lx，光照時間12 h/d。

1.2.4 試管苗移栽試驗。將已經(jīng)生根的黃樹莓試管苗在常溫、自然光下逐漸揭開封口膜，煉苗3～5 d，初期每天噴霧4次，逐漸減少噴霧次數(shù)。然后將苗取出，用清水洗去根部培養(yǎng)基，再用0.1%的代森鋅溶液浸泡15 min，移栽到用0.5%高錳酸鉀溶液消毒的以下基質(zhì)中:①草炭;②樹皮+闊葉(1∶1);③針葉+樹皮+草腐菌菌糠(1∶1∶1);④草炭+稻殼+樹皮(1∶1∶1);⑤針葉+鋸末(1∶1)中。用塑料膜覆蓋7 d保持空氣相對濕度在75%左右，適當噴水。每個處理栽種30株，重復3次。30 d后統(tǒng)計成活率及苗木生長狀況。

1.2.5 黃樹莓莖尖脫毒試驗

1.2.5.1 微莖尖脫毒培養(yǎng)試驗。將生長良好的試管苗切成單芽莖段，在100×顯微鏡下用解剖針剝?nèi)△[片和葉原基(解剖針放入0.1%的HgCl2溶液中滅菌10 min，然后用無菌水反復沖洗干凈)，當形狀為一個閃亮半圓球的頂端分生組織充分暴露出來時，用手術刀片將莖尖分生組織切下，分別切取 0.1、0.2、0.5 mm 微莖尖接入培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 30、80、130 d分別觀察并記錄。

1.2.5.2 微莖尖脫毒培養(yǎng)基礎上的熱處理試驗。將繼代或生根的莖尖脫毒苗置于光照培養(yǎng)箱中，用熱空氣處理脫毒。相對濕度保持75% ～85%，光照強度為2 500～3 000 lx，光周期14 h/10 h(光照/黑暗)。然后通過初始25℃，25～36℃每天增加0.5℃，36～38℃時每2 d增加0.5℃，38℃時保持7 d，此后再每2 d增加0.5℃，隨時觀察記錄結果，當有植株出現(xiàn)嚴重燙傷癥狀或枯死時停止加溫，準備二次切取莖尖。供試苗木10株，重復2次，記錄熱處理效果。

1.2.5.3 熱處理脫毒基礎上的二次微莖尖脫毒試驗。將經(jīng)過熱處理且生長較好的試管苗放在超凈工作臺上，置于100×顯微鏡下，剝?nèi)∥⑶o尖，方法與“1.2.5.2”同。此次剝?nèi)?.5 mm的長度進行二次微莖尖培養(yǎng)，30、60、90 d分別觀察結果并記錄。

1.2.5.4 病毒檢測。運用酶聯(lián)檢測儀(ELISA)進行脫毒結果檢測。

1.2.5.5 脫毒苗增殖和生根試驗。將經(jīng)病毒檢測后的黃樹莓脫毒苗參照上述增殖、生根培養(yǎng)試驗所得出的最佳培養(yǎng)方法，重復擴繁生根培養(yǎng)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件DPS7.05對試驗結果進行方差分析和差異顯著性測驗(SSR法)［6］。

2 結果與分析

2.1 不同滅菌時間對黃樹莓外植體的影響 在接種后第3天觀察外植體，發(fā)現(xiàn)滅菌不徹底的莖段開始出現(xiàn)污染現(xiàn)象。經(jīng)氯化汞滅菌4 min的試材污染率較高;滅菌4 min和6 min的試材均無褐化現(xiàn)象，滅菌8 min的試材無污染但部分外植體切口處出現(xiàn)褐化。這說明氯化汞滅菌6 min可以達到滅菌的目的，且對黃樹莓外植體無損傷(表2)。

2.2 誘導黃樹莓側芽生長情況 觀察表明，腋芽在初代培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d開始萌動，培養(yǎng)7 d節(jié)間伸長，小葉片展開。

2.3 不同處理對黃樹莓苗木增殖的影響 將伸長的莖梢切成莖段，單芽莖段轉入增殖培養(yǎng)基。對不同處理增殖培養(yǎng)35 d的試管苗進行極差分析，結果表明，對于株高影響最大的因素是GA3(B)，說明赤霉素的含量直接影響試管苗的向上生長速度，在該試驗所選定的濃度范圍內(nèi)，試管苗的株高隨赤霉素含量的升高而增加;6-BA(A)是影響試管苗增殖培養(yǎng)的主要因素，且在該試驗所選定的濃度范圍內(nèi)，試管苗的增殖分化數(shù)隨6-BA含量的增加而增加。方差分析結果表明，A、B、C因素間差異極顯著(P＜0.01)。植株上部生長情況的多重比較結果顯示，以處理③培養(yǎng)的試管苗向高生長最快，且處理間差異顯著;以處理⑧培養(yǎng)的試管苗分化增殖苗數(shù)最多，且與其他處理間差異顯著(P＜0.05)。對于分化增殖培養(yǎng)而言，在保證試管苗增殖率的前提下，應選擇苗木生長旺盛的處理。因此，選擇培養(yǎng)基(即處理⑧)MS+6-BA 2.0 mg/L+GA30.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L 為黃樹莓的分化增殖培養(yǎng)基，分化苗數(shù)較多，植株生長健壯(表3)。

2.4 不同處理對黃樹莓試管苗生根的影響 當苗高1.5～2.0 cm時，切取單芽分別轉接于生根培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。培養(yǎng)10 d左右開始長出白色的根，根較細，但根系密集，分支較多。對培養(yǎng)30 d的試管苗進行方差分析，結果表明無論從生根數(shù)量還是根長方面，各處理間差異極顯著(P＜0.01)。經(jīng)SSR法多重比較結果(表4)表明，無論從生根數(shù)量還是根長，均以處理①最好，經(jīng)處理①培養(yǎng)30 d的試管苗平均生根9.48條，長度達2.0 cm。生根速度快，根系生長旺盛，分支多，吸收能力強，有利于提高移栽成活率。因此，選擇培養(yǎng)基(即處理①)即1/2MS+IBA 0.2 mg/L為黃樹莓的生根培養(yǎng)基。

表4 不同處理苗木生根數(shù)量和生根長度

2.5 黃樹莓試管苗移栽 由表5可知，處理③［即針葉+樹皮+草腐菌菌糠(1∶1∶1)］培養(yǎng)的苗木長勢較好，莖桿相對粗壯，有效光合葉片數(shù)較多，易于有機物的合成與積累，有利于苗木進一步生長繁殖。

表5 移栽苗長勢情況

2.6 黃樹莓莖尖脫毒培養(yǎng)研究

2.6.1 微莖尖脫毒培養(yǎng)效果。由于病毒在植物體內(nèi)分布不均性，莖尖沒有病毒或濃度較低。因此該試驗采用生長發(fā)育快的試管苗進行莖尖脫毒培養(yǎng)。結果表明，不同規(guī)格的莖尖其顯綠時間、成苗時間和成苗率不同(表6)。

表6 微莖尖脫毒培養(yǎng)生長情況

采用不同程度的微莖尖脫毒處理，理論上莖尖越小帶毒概率越低，但綜合考慮苗木脫毒效率、成活率和成苗時間等因素，故采用0.2 mm作為微莖尖處理的最適長度。0.5 mm莖尖的成苗率最高，但脫毒效果不好;0.1 mm的莖尖剝?nèi)±щy，且成苗率低。

2.6.2 微莖尖脫毒培養(yǎng)基礎上的熱處理脫毒效果。通過不同溫度處理的預試驗與資料參考［7］，確定試管苗的耐熱溫度與極限溫度的保持時間，從而篩選出黃樹莓合理有效的熱處理脫毒途徑。

試驗結果表明，通過初始25℃培養(yǎng)，然后采取溫度逐漸上升的方式，在38～40℃保持時間較長;繼代苗、生根苗所能承受的極限溫度也不同，分別為37.2和40.8℃，保持時間分別為13和15 d，此時導致病毒致死或鈍化。同時生根苗在各個溫度梯度的抗熱性明顯優(yōu)于繼代苗。

2.6.3 熱處理基礎上的二次微莖尖脫毒研究。由表7可知，利用腋芽進行二次微莖尖處理比頂芽莖尖效果好，由于在極限溫度下，頂芽處于細胞分裂生長時期，極限溫度導致其愈傷組織生理發(fā)生變異，玻璃化現(xiàn)象明顯，而腋芽在溫度適宜時形成，以后基本處于分化停滯階段，培養(yǎng)環(huán)境的劇烈溫度變化對其傷害相對較小。

表7 二次微莖尖脫毒培養(yǎng)生長情況

經(jīng)過上述脫毒培養(yǎng)的試管苗按照篩選出的苗木擴繁、生根培養(yǎng)基配方培養(yǎng)，獲得脫毒組培苗木(圖1)。

3 結論與討論

(1)增殖培養(yǎng)是試管苗快速繁育的基礎，只有選擇合適的激素及濃度才有利于黃樹莓組培苗的生長繁育。該試驗結果表明，美國黃樹莓的最適增殖培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 2.0 mg/L+GA30.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L，分化苗數(shù)較多，葉色深綠，植株生長健壯。以1/2MS+IBA 0.2 mg/L為黃樹莓的生根培養(yǎng)基，生根率較高，生根速度快，根系生長旺盛，分支多，吸收能力強，有利于提高移栽成活率。對于黃樹莓而言，激素IBA、NAA均可促進其生根，說明它對于生根激素的要求較寬泛。

(2)該研究應用二次微莖尖脫毒和熱處理脫毒相結合的脫毒措施對美國引進黃樹莓進行了研究，揭示了對黃樹莓用0.2、0.5 mm微莖尖進行二次莖尖脫毒并結合熱處理的最佳脫毒方法，應用ELISA特異性植物病毒檢測法對其脫毒效果進行了檢測。該研究建立了黃樹莓全程脫毒苗工廠化育苗的快繁體系，應用此技術模式可大規(guī)模進行脫毒苗工廠化育苗，解決了目前制約我國黃樹莓產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的瓶頸問題，為快速建立我國黃樹莓產(chǎn)業(yè)基地與無毒苗良種化的大面積推廣起到了推動作用。

(3)對于移栽試驗而言，摻有稻殼的基質(zhì)黃樹莓試管苗成活率低，且此類基質(zhì)保水性差，極易失水，造成苗木萎蔫，不建議使用稻殼作為試管苗移栽基質(zhì)組成成分。

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