一株腐敗希瓦氏菌的篩選鑒定及其染料脫色研究

江瑩，桂震，齊杭杭，羅安杰，劉柳，葉鏵駿，蔡亞君(武漢紡織大學環(huán)境工程學院，湖北武漢430073)

紡織印染廢水有機污染物含量高、色度深、堿性大、水質(zhì)變化大，一直是難處理的工業(yè)廢水之一［1］，對其處理通常是將物理法、化學法和生物法串聯(lián)在一起進行，首先通過物理、化學方法將大部分的有機污染物和色度去除，再采用生物方法將剩余的污染物和色度處理到可以達標排放的水平。因為生物處理方法成本低而且無二次污染，所以在其中起主導作用。但傳統(tǒng)的建立在細菌系統(tǒng)上的生物處理技術對非偶氮染料基本沒有脫色效果，偶氮染料可以在厭氧條件下脫色，但是幾乎不能在好氧條件下脫色。筆者從印染廢水中篩選到一株既可在厭氧條件下、也可在好氧條件下對偶氮染料脫色，同時也能在缺氧條件下對蒽醌染料脫色的細菌菌株，對其進行了菌種鑒定，并對其對偶氮和蒽醌染料的脫色條件進行了初步研究。

1 材料與方法

1．1 菌株來源 菌株篩選自某印染廠廢水處理廠二沉池活性污泥。

1．2 主要試劑和儀器 用于總基因組提取、PCR產(chǎn)物回收和pMD 18-T載體連接的試劑盒及大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α感受態(tài)細胞均購自Takara公司。主要儀器有紫外分光光度計、美國ABI 9800 PCR儀、美國BioRad DNA電泳系統(tǒng)、美國VITEK32全自動細菌鑒定系統(tǒng)。

1．3 高效降解菌的分離及鑒定 將印染廢水1∶100加入50 ml濃度為50 mg/L的活性艷藍KN-R的LB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，pH 7．0 ～7．5)中，分別在0、50、100、150、200 r/min 轉(zhuǎn)速下、30 ℃下進行培養(yǎng)，定期觀察培養(yǎng)基中菌體量及溶液顏色變化。將上清顏色明顯褪去的培養(yǎng)物按1∶100轉(zhuǎn)接到新鮮的50 ml濃度為50 mg/L的活性艷藍KN-R的LB培養(yǎng)基中，重新培養(yǎng)，如此富集培養(yǎng)3次后，將上清脫色效果最好的培養(yǎng)液離心分離菌體，并用無菌水洗滌3次，后懸浮于無菌水中，采用10倍系列梯度等比稀釋法將其涂布于50 mg/L活性艷藍KN-R的LB固體培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)，將分離得到的單菌落分別挑至5 ml 50 mg/L活性艷藍KN-R的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察各自脫色情況，選取效果最好的菌進行平板劃線分離純化。將分離純化得到的菌株通過美國VITEK32全自動細菌鑒定系統(tǒng)進行生理生化特性鑒定，并提取其總基因組，通過PCR擴增其16S rDNA，擴增得到的PCR產(chǎn)物純化后連接到pMD 18-T載體并轉(zhuǎn)化進大腸桿菌DH5α菌株中，在含有50 μg/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上挑取克隆子酶切驗證后送樣測序，測得的序列通過Blast獲得其種屬信息。

1．4 高效降解菌對染料的脫色研究 將單菌落轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基，30℃、150 r/min培養(yǎng)過夜后轉(zhuǎn)接到分別含50 mg/L活性艷紅X-3B和50 mg/L活性艷藍KN-R的LB培養(yǎng)基中，研究在不同溫度、pH、通氣量條件下培養(yǎng)時該菌對兩種染料的脫色效果。

2 結(jié)果與分析

2．1 高效染料降解菌株的分離與鑒定

2．1．1 分離。經(jīng)過篩選，得到一株對活性艷藍KN-R染料具有很好脫色作用的細菌，該菌在初始接種菌體量107～108CFU/ml、30℃左右靜止培養(yǎng)時，在48 h內(nèi)使50 mg/L以下濃度活性艷藍KN-R脫色70%左右;而在6 h內(nèi)即可使50 mg/L以下濃度活性艷紅X-3B及多種偶氮染料完全脫色。但對活性艷藍進行處理時，以染料作為唯一碳源和能源時不能脫色，必須添加其他碳源才能具有脫色效果，且培養(yǎng)液顏色褪去時發(fā)現(xiàn)菌體顏色先變藍后恢復原色;而對活性艷紅等偶氮染料進行處理時，以染料作為唯一碳源和能源時可將染料脫色，且在平板上培養(yǎng)時可觀察到水解圈現(xiàn)象，因此推測該菌可分泌胞外酶降解偶氮染料，而對活性艷藍則是一種先吸附、后共代謝的脫色機制。

2．1．2 鑒定。

2．1．2．1 形態(tài)學結(jié)果。該菌在LB平板上培養(yǎng)時，菌落表面濕潤、光滑，淺黃色，不透明，邊緣整齊，呈凝滴狀(圖1a)，菌體呈短桿狀(圖1b)。

2．1．2．2 生理生化鑒定結(jié)果。依據(jù)VITEK細菌鑒定系統(tǒng)的預處理要求，將4H菌進行革蘭氏染色，發(fā)現(xiàn)為陰性;緊接著將菌落做了氧化酶試驗，結(jié)果呈陽性，屬于非發(fā)酵菌。將純種菌50℃下培養(yǎng)6 h，選擇非發(fā)酵菌的BAC藥敏卡，進行全自動鑒定，鑒定結(jié)果見表1，最終鑒定結(jié)果顯示該菌為希瓦氏菌(Shewanella sp．)。

表1 菌株4H生理生化鑒定結(jié)果

2．1．2．3 16S rDNA序列鑒定結(jié)果。將該菌的16S rDNA序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫，進行BLAST對比發(fā)現(xiàn)，該菌與所有希瓦氏菌屬(Shewanella)菌株16S rDNA序列相似性均達90%以上，與腐敗希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)多個菌株的16S rDNA序列相似性均達97%(圖2)，與其他希瓦氏菌的相似性也均達90%以上。因此，該菌初步可確定為S．putrefaciens，命名為 S．putrefaciens 4H。

2．2 Shewanella sp．4H對染料的脫色研究 以50 mg/L活性艷紅X-3B和活性艷藍KN-R為目標，將Shewanella sp．4H菌株單菌落轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基，30℃、150 r/min過夜活化培養(yǎng)后按1∶100分別轉(zhuǎn)接至裝有50 ml 50 mg/L活性艷紅X-3B和活性艷藍KN-R LB培養(yǎng)基(pH=7．0)的250 ml三角瓶中，30℃下靜置培養(yǎng)，定時取樣檢測菌體生長量(OD600)和染料脫色效果。由圖3a可知，該菌在含50 mg/L活性艷紅X-3B的LB培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)6 h左右即可將染料完全脫色(肉眼觀察)，此時仍處于菌株的對數(shù)生長期;而在50 mg/L活性艷藍KN-R的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后進入穩(wěn)定生長期，48 h后脫色率可達最大值(70%左右)(圖3b)。

2．2．1 溫度對Shewanella sp．4H菌株染料脫色效果的影響。將Shewanella sp．4H菌株在 LB液體培養(yǎng)基中30℃、150 r/min過夜活化培養(yǎng)的培養(yǎng)物按1∶100分別轉(zhuǎn)接至裝有50 ml含50 mg/L活性艷紅X-3B和活性艷藍KN-R LB培養(yǎng)基(pH=7．0)的250 ml三角瓶中，不同溫度下靜置培養(yǎng)，定時取樣檢測菌體生長量(OD600)和染料脫色效果。由圖4可知，該菌在37℃時菌體生長量及染料脫色率均最高，其次為40℃;在50 mg/L活性艷紅X-3B的培養(yǎng)基中，溫度低于30℃時菌株生長量明顯減少，但最終仍能將染料脫色完全，而高于42℃則菌體幾乎不生長，也不表現(xiàn)脫色作用;在50 mg/L活性艷紅X-3B的培養(yǎng)基中，溫度越低，菌體生長量及染料脫色率均越低，而在45℃時菌體少量生長，具有一定的脫色作用(最高脫色率27．19%)，50℃以上菌體不生長，也不表現(xiàn)脫色作用。

2．2．2 pH對Shewanella sp．4H菌株染料脫色效果的影響。將Shewanella sp．4H菌株在 LB液體培養(yǎng)基中30℃、150 r/min過夜活化培養(yǎng)的培養(yǎng)物按1∶100分別轉(zhuǎn)接至裝有50 ml 50 mg/L活性艷紅X-3B和活性艷藍KN-R LB培養(yǎng)基(pH不同)的250 ml三角瓶中，37℃下靜置培養(yǎng)，定時取樣檢測菌體生長量(OD600)和染料脫色效果。由圖5可知，在pH為6～8時，該菌在兩種染料培養(yǎng)基中均能生長良好;在pH=7和pH=8時生長最好，且染料脫色率最高，pH=8時最優(yōu)(脫色率分別為90．42%和81．84%)。

2．2．3 通氣量對Shewanella sp．4H菌株染料脫色效果的影響。將Shewanella sp．4H菌株在LB液體培養(yǎng)基中30℃、150 r/min過夜活化培養(yǎng)的培養(yǎng)物按1∶100分別轉(zhuǎn)接至裝有50 ml 50 mg/L活性艷紅X-3B和活性艷藍KN-R LB培養(yǎng)基(pH=8．0)的 250 ml三角瓶中，37 ℃下分別在轉(zhuǎn)速 0、50、150 r/min下培養(yǎng)，定時取樣檢測菌體生長量(OD600)和染料脫色效果。由圖6可知，該菌在培養(yǎng)時搖床轉(zhuǎn)速越高，菌體生長越快，但脫色效果越差，靜置培養(yǎng)時對兩種染料的脫色效果均最好(脫色率分別為99．12%和77．18%)。鑒于此，又進一步比較了在相同規(guī)格的三角瓶(250 ml)中裝樣量分別為50、100、150 ml時該菌的生長情況及對染料的脫色情況。結(jié)果顯示(圖7)，裝樣量越少，菌體生長越好，但對染料最終的脫色效果影響不大，推測已有菌體已足夠?qū)⒑械娜玖先棵撋?/p>

3 結(jié)論與討論

篩選到的4H菌株對50 mg/L偶氮染料活性艷紅X-3B及蒽醌染料活性艷藍KN-R均具有很好的脫色能力，尤其對活性艷紅X-3B處理6 h后即能完全脫色。研究結(jié)果顯示，在pH=8、37℃下靜置培養(yǎng)時脫色效果最好。該菌株在活性艷紅X-3B的平板上培養(yǎng)時可產(chǎn)生水解圈，推斷該菌株能分泌降解活性艷紅X-3B的胞外酶;該菌株在對50 mg/L活性艷藍KN-R處理48 h時達到最大脫色率，雖然僅為81．84%，但肉眼觀察已經(jīng)脫色完全，推測通過分光光度法檢測該染料濃度時受培養(yǎng)基及菌體代謝物的影響較大;而且該菌必須在培養(yǎng)過程中首先將活性艷藍KN-R吸入菌體后再逐步將染料降解，推測該菌株降解活性艷藍KN-R的方式是先吸附、后共代謝方式。后續(xù)將對該菌株對活性艷紅X-3B類偶氮染料和活性艷藍KN-R類蒽醌染料的脫色機理進行具體研究。

篩選到的4H菌株經(jīng)鑒定屬于希瓦氏菌屬腐敗希瓦氏菌種，目前希瓦氏菌屬已發(fā)現(xiàn)了超過40個種的菌株。希瓦氏菌能利用有機物產(chǎn)生能量，且呼吸類型多樣，其應用范圍涵蓋了醫(yī)學、環(huán)境科學、電化學、海洋生物學等多個領域。其中，4H菌株所屬的腐敗希瓦氏菌(S．putrefaciens)在各種環(huán)境中廣泛分布，常見于富含有機質(zhì)的沉積物和地下厭氧環(huán)境中，在厭氧環(huán)境中，腐敗希瓦氏菌能將腐殖質(zhì)作為電子穿梭物質(zhì)還原 Fe(III)［2－5］、Mn(IV)［5］、Cr(VI)［6］、U(VI)［6－8］等金屬鹽和硝酸鹽［9］以及有機污染物［9-12］等。近些年來，還發(fā)現(xiàn)某些腐敗希瓦氏菌株能產(chǎn)電［13］，而腐敗希瓦氏菌對染料降解方面的研究則主要集中于對偶氮染料的降解［14-15］，對蒽醌染料降解方面研究較少。因此，該研究篩選到的S．putrefaciens 4H菌株雖然對染料的脫色作用不如脫色希瓦氏菌［16］，但其在環(huán)境污染治理方面的潛力巨大，具有很高的研究價值。

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