糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)重組轉(zhuǎn)基因二元載體pElrLEG的構(gòu)建

王宏歸，黃 晨，姜 雅，嚴(yán)秋香，周春洪

(1.揚(yáng)州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225127;2.揚(yáng)州大學(xué)測(cè)試中心，江蘇揚(yáng)州225009)

常見(jiàn)的誘導(dǎo)型載體有四環(huán)素類(lèi)、糖皮質(zhì)激素類(lèi)、雌激素類(lèi)、酒精類(lèi)、蛻皮(Ecdysone)激素類(lèi)、金屬類(lèi)。這些類(lèi)型的誘導(dǎo)載體各有優(yōu)劣。四環(huán)素誘導(dǎo)型載體，其四環(huán)素使用量大，不僅對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害，而且對(duì)環(huán)境也會(huì)造成危害;雌激素誘導(dǎo)型載體，由于雌激素在植物體內(nèi)不易擴(kuò)散，局部誘導(dǎo)性強(qiáng)，因此不適宜對(duì)整株植物誘導(dǎo);蛻皮激素誘導(dǎo)型載體，其缺點(diǎn)是葉片對(duì)蛻皮激素吸收差;酒精誘導(dǎo)型載體，其缺點(diǎn):酒精對(duì)植物有毒害作用，且易揮發(fā);銅誘導(dǎo)型載體，誘導(dǎo)素元銅對(duì)細(xì)胞有毒害作用，且其擴(kuò)散有限;地塞米松是糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型表達(dá)載體的誘導(dǎo)劑，不僅無(wú)毒，而且可以高效地被運(yùn)輸?shù)街参锏母鱾€(gè)組織。

正因?yàn)榈厝姿删哂幸陨蟽?yōu)點(diǎn)，所以糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型表達(dá)載體適合用于植物轉(zhuǎn)基因。目前研究大部分都是將GR-Cre重組酶片段和Loxp位點(diǎn)分別構(gòu)建在2個(gè)Ti質(zhì)粒的T-DNA上，要實(shí)現(xiàn)Loxp位點(diǎn)的重組，必須將2個(gè)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行雜交，如果將GR-Cre重組酶片段和Loxp位點(diǎn)同時(shí)構(gòu)建在同一個(gè)載體上，那么Loxp位點(diǎn)的重組無(wú)需通過(guò)雜交，這樣既可以節(jié)省時(shí)間也可以減少工作量［1－3］。

由于重組酶能使Loxp位點(diǎn)的DNA發(fā)生重組，而DNA位于細(xì)胞核內(nèi)，因此，Gre只能在細(xì)胞核內(nèi)起作用。Cre與GR的融合蛋白，在不外加地塞米松時(shí)，GR-Cre通過(guò)GR結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，DNA重組不能發(fā)生;當(dāng)有地塞米松時(shí)，GR-Cre通過(guò)GR與地塞米松結(jié)合，使得GR-Cre從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫落，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合到Loxp位點(diǎn)上，引發(fā)重組［4－5］。在Loxp位點(diǎn)之間還含有一個(gè)Gateway cassette和多克隆位點(diǎn)(MCS)，Gateway克隆技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是不受酶切位點(diǎn)的限制，該載體的Gateway cassette含有attR1和attR2兩個(gè)重組位點(diǎn)，這個(gè)位點(diǎn)用于克隆不同的啟動(dòng)子，而多克隆位點(diǎn)(MCS)位于Gateway cassette的后面，用于目的基因的克?。?］。位于loxP位點(diǎn)之間的DNA，將在外加地塞米松的情況下，引發(fā)DNA重組而被敲除［7－11］。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗(yàn)所用菌株是DH5α 與DB3.1，DB3.1用于進(jìn)行克隆或者擴(kuò)繁含有Gateway片段的質(zhì)粒［6］。質(zhì)粒是pJawoh18-RNAi、pCre、pUC57。限制性內(nèi)切酶及 T4DNA 連接酶均購(gòu)自于NEB公司。PCR引物由primer5設(shè)計(jì)，PrimerSTAR TM HS Polymerase購(gòu)自于TaKaRa公司。試驗(yàn)中使用的引物:GR-Cre F:CGGGCTAGCATGTCCAATTTACTGACCGTACAC，R:CGG CCATGGTCATTTTTGATGAAACAGAAGCTT，2 059 bp;GatewayF:CGGCGTACGATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCT GA，CassetteR:CGGGGTACCACCACTTTGTACAAGAAAG CTG1，1 706 bp。

1.2 方法 PCR反應(yīng)體系:模板DNA 0.5 μl，正反向引物(10 μmol/L)各 1 μl，10 × buffer 5 μl，dNTPs(10 mmol/μl)5 μl，DNA 聚合酶 0.5 U，加水補(bǔ)齊 50 μl。酶切體系:DNA 1 μg，buffer 2 μl，內(nèi)切酶各加1 U，加水補(bǔ)齊20 μl，37 ℃酶切過(guò)夜，連接體系:載體:目的片段為 1∶3～1∶9，T4連接酶 1 U，buffer 2 μl，加水補(bǔ)齊 20 μl，4 ℃連接過(guò)夜。

2 結(jié)果與分析

2.1 Loxp-nos-Loxp(XhoI-SofI-Loxp-NheI-NcoI-NOS-BsiwI-KpnI-StuI-BgIII-MfeI-AatII-1xMyc-Loxp-SpeI)片段的合成 Loxp-nos-Loxp(南京金斯瑞生物科技公司合成)是以XhoI及SpeI位點(diǎn)克隆在pUC57載體上。該片段含有2個(gè)同向Loxp位點(diǎn)，NOS終止信號(hào)序列位于NcoI與BsiwI位點(diǎn)之間。Myc標(biāo)簽用于蛋白表達(dá)檢測(cè)，多克隆位點(diǎn)用于克隆基因(圖1)。

2.2 工程質(zhì)粒的構(gòu)建 以pJawoh18-RNAi二元載體為骨架，利用XhoI及SpeI酶切位點(diǎn)將Loxp-nos-Loxp克隆到pJawoh18-RNAi載體上，即pElrL載體(圖2)。利用GR-Cre的引物從pCre載體［12－13］上擴(kuò)增 GR-Cre片段，再利用 NheI與NcoI酶切位點(diǎn)，將GR-Cre克隆到pElrL載體上，即pElrLC載體(圖2)。將Gateway擴(kuò)增片段，經(jīng)BsiwI與KpnI酶切后并回收，并克隆至pElrLC上，即pElrLCG載體(圖2)。

3 討論

Cre是從噬菌體P1分離出來(lái)的DNA特異位點(diǎn)重組酶。Loxp位點(diǎn)是Cre識(shí)別位點(diǎn)，其最早也是在P1噬菌體中被發(fā)現(xiàn)。loxP在兩端有13個(gè)反向重復(fù)的堿基，中間核心序列是8個(gè)非回文結(jié)構(gòu)的堿基，共34個(gè)堿基。Cre重組酶識(shí)別并結(jié)合在loxP位點(diǎn)的兩端，并從中間核心序列區(qū)將loxP切開(kāi)。2個(gè)同向的loxP位點(diǎn)，在重組酶的作用下將2個(gè)loxP切開(kāi)從而產(chǎn)生4個(gè)黏性末端，loxP位點(diǎn)之間的序列會(huì)自我連接成環(huán)，從而從基因組中環(huán)出丟失。

pElrLCG該載體的優(yōu)點(diǎn):①地塞米松作為誘導(dǎo)化學(xué)物質(zhì)對(duì)植物無(wú)毒害作用，而且可以高效地被運(yùn)輸?shù)街参锏母鱾€(gè)組。②該載體可以同時(shí)使用Gateway克隆技術(shù)以及常規(guī)酶切連接克隆技術(shù)。③GR-Cre重組酶表達(dá)后，可以通過(guò)是否施加地塞米松來(lái)控制Cre的入核，從而人為控制何時(shí)把轉(zhuǎn)入的基因從基因組中刪除掉。④該載體在雜交育種中也有很大潛力，如花粉不育的性狀優(yōu)良的母本，利用含有目的基因的載體即可得到花粉可育(轉(zhuǎn)基因)和花粉不育(轉(zhuǎn)入的目的基因環(huán)出丟失)的植株，這樣花粉可育的植株可以用來(lái)繁殖種子，而花粉不育的植株可以用作雜交育種的母本。⑤該載體的Myc標(biāo)簽可以用于檢測(cè)轉(zhuǎn)入的基因是否表達(dá)。⑥該載體在施加地塞米松誘導(dǎo)后，GR-Cre進(jìn)入核引發(fā)Loxp位點(diǎn)重組，Loxp位點(diǎn)之間的DNA片段從基因組里環(huán)出，由于環(huán)出的DNA片段包含了GR-Cre以及轉(zhuǎn)入的基因，而又不含有啟動(dòng)子與3'末端加尾信號(hào)。因此，只要Loxp位點(diǎn)重組發(fā)生，GR-Cre及目的基因的轉(zhuǎn)錄即終止?？傊?，該載體在實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因，可以選擇性地關(guān)閉/刪除目的基因。

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