• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于內(nèi)參的大腸埃希氏菌O157∶H7實時熒光定量PCR快速檢測方法的建立

    2015-12-21 08:12:58王建昌王金鳳段永生陳志敏陳瑞春
    食品科學(xué) 2015年20期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)參探針定量

    王建昌,王金鳳,段永生,李 靜,陳志敏,陳瑞春*

    (河北出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心,河北 石家莊 050051)

    基于內(nèi)參的大腸埃希氏菌O157∶H7實時熒光定量PCR快速檢測方法的建立

    王建昌,王金鳳,段永生,李 靜,陳志敏,陳瑞春*

    (河北出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心,河北 石家莊 050051)

    針對大腸埃希氏菌O157∶H7 rfbE和Flic靶基因保守序列,設(shè)計特異性引物和探針,優(yōu)化反應(yīng)體系,并加入內(nèi)參(internal amplification control,IAC),建立能夠?qū)崟r監(jiān)控反應(yīng)過程的熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymease chain reaction,PCR)檢測方法。結(jié)果表明,該方法對E. coli O157∶H7基因組DNA的最低檢測限為1 pg/μL;對含有靶基因質(zhì)粒的最低檢測限為103copies/μL;對細(xì)菌的最低檢測限為5×103CFM/mL;Ct值與模板拷貝數(shù)均呈良好的線性關(guān)系(R2=0.999)。人工污染實驗結(jié)果表明,在初始菌量為7 CFM/25 g時,采用水洗加試劑盒法提取DNA,E. coli O157∶H7在增菌6 h后即可檢出;而采用水煮法提取DNA,則在增菌10 h后方可檢出。建立的E. coli O157∶H7實時熒光定量PCR方法,既能有效檢測食品中O157∶H7,又能實時監(jiān)測PCR反應(yīng)過程,有效防止“假陰性”的發(fā)生。

    大腸埃希氏菌O157∶H7;rfbE;Flic;實時熒光定量PCR;內(nèi)參

    大腸埃希氏菌O157∶H7(Escherichia coli O157∶H7,E. coli O157∶H7)是腸出血型大腸埃希氏菌的一種主要血清型,可引起人出血性結(jié)腸炎、溶血性尿毒綜合征以及血栓形成性血小板減少性紫癜等[1],是一種危害嚴(yán)重的食源性病原微生物。E. coli O157∶H7廣泛分布于自然界,嚴(yán)重威脅公眾健康[2]。該菌在豬、牛糞便及豬肉、牛肉[3]中分離率極高,其引起的疾病也與食用未烘烤的餅干面團(tuán)[4]、生菜[5]等有關(guān)。E. coli O157∶H7多暴發(fā)于發(fā)達(dá)國家,在美國和加拿大監(jiān)測的腸道致病菌中,該菌分別排在第2位和第3位。自1987年我國權(quán)太叔[6]首次分離出該菌之后,相繼有安徽、江蘇、河南、湖北等十多個省份報道了該菌的感染情況[7-8]。河北省疾病預(yù)防控制中心對隨機(jī)抽取的530 份熟肉制品、生肉、蔬菜海產(chǎn)品的檢測表明,E. coli O157∶H7均從生肉中檢出,陽性檢測率為0.9%[9],說明食用生肉仍是其感染的主要途徑。江蘇省徐州市2006—2009年對E. coli O157∶H7的檢出率為1.21%[10]。E. coli O157∶H7時刻威脅著人們的健康,因而快速特異的檢測方法有效控制該菌是十分必要的。

    E. coli O157∶H7傳統(tǒng)的分離鑒定法的操作步驟一般包括樣品增菌、選擇性增菌、生化特征鑒定與血清分型,操作復(fù)雜,一般需要5~6 d。胡慧[11]、蔣彥君[12]等分別建立了E. coli O157∶H7的熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymease chain reaction,PCR)和PCR檢測方法,上述PCR方法多數(shù)對該菌純培養(yǎng)物進(jìn)行了靈敏性、檢測限的分析,但未對增菌時間和增菌后樣品核酸提取進(jìn)行研究評估。而在PCR檢測方法的實際應(yīng)用中,大部分樣品基質(zhì)復(fù)雜,必定存在大量未知的復(fù)雜成分,可能會存在影響PCR擴(kuò)增的物質(zhì),同時核酸提取過程中殘留的物質(zhì)也可能導(dǎo)致PCR擴(kuò)增的抑制,從而出現(xiàn)“假陰性”結(jié)果或定量值較低。

    本研究所建立的E. coli O157∶H7檢測方法是一種基于內(nèi)參的實時熒光定量PCR方法,在反應(yīng)體系中添加IAC以對整個反應(yīng)過程進(jìn)行實時監(jiān)測,從而有效地防止“假陰性”結(jié)果的產(chǎn)生,并通過水煮法和商業(yè)化試劑盒法對增菌后樣品提取核酸進(jìn)行靶基因檢測,均取得了良好的檢測結(jié)果。

    1 材料與方法

    1.1 實驗菌株

    本實驗所用菌株見表1。

    1.2 試劑與儀器

    大腸埃希氏菌O157顯色平板 鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司;改良EC肉湯 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR Master Mix 北京天根生化科技有限公司;pMD?19-T SimpleVector、Premix Ex Taq 大連寶生物公司;BioPhotometer Plus核酸蛋白分析儀 德國Eppendorf公司;Tprofessional PCR儀 德國Biometra公司;7500型實時熒光定量PCR儀 美國ABI公司。

    1.3 方法

    1.3.1 引物和探針的設(shè)計

    通過查找相關(guān)文獻(xiàn)[13-15],選擇rfbE和Flic作為O157∶H7檢測靶基因。從GenBank中下載rfbE和Flic靶序列,應(yīng)用DNAstar軟件對下載的多個靶序列進(jìn)行比對,查找保守序列。用Primer Express 3.0軟件設(shè)計引物和探針,用BLAST工具進(jìn)行比對,分析其特異性。所有引物、探針均由大連TaKaRa公司合成。引物和探針序列詳見表2。

    表2 實驗中所用引物探針序列信息Table2 Information about the primers and probes

    1.3.2 擴(kuò)增內(nèi)參的構(gòu)建

    采用復(fù)合引物法[16]構(gòu)建IAC,選擇乳倉鼠腎細(xì)胞(BHK-21)的Nmi基因作為內(nèi)參基因,使用Primer Express 3.0軟件設(shè)計擴(kuò)增內(nèi)參引物和探針(序列見表2),將內(nèi)參探針標(biāo)記CY5熒光基團(tuán),在內(nèi)參引物5’末端分別連接上rfbE檢測引物,形成一對內(nèi)參引物和目標(biāo)引物的長引物,經(jīng)長引物擴(kuò)增后得到擴(kuò)增內(nèi)參。內(nèi)參片段連接載體pMD19-T,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,測序驗證;提取質(zhì)粒,測定濃度,-20 ℃保存?zhèn)溆?,菌液于甘油中?0 ℃保存。

    1.3.3 E. coli O157∶H7基因組DNA的提取

    本研究中E. coli O157∶H7基因組DNA的提取分別采用以下2 種方法進(jìn)行。

    1.3.3.1 水煮法

    將1 mL菌液轉(zhuǎn)入1.5 mL Eppendorf離心管中5 000~8 000 r/min離心5 min,棄上清液收集菌體。加入200 μL無菌去離子水,振蕩混勻,100 ℃水浴10 min后,12 000 r/min離心10 min,上清液作為DNA模板-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.3.2 水洗法加天根提取試劑盒法

    取增菌液樣品1 mL,放入1.5 mL離心管中,800 r/min離心5 min或靜置5~10 min,沉淀培養(yǎng)物中的食品殘渣。取上清液,在8 000 r/min離心5 min,收集菌體。倒去上清液后,用無菌雙蒸水重懸浮菌體,離心洗滌3 次,然后將沉淀用試劑盒進(jìn)行DNA提取。

    1.3.4 基于內(nèi)參的E. coli O157∶H7實時熒光定量PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化

    以E. coli O157∶H7基因組DNA作為模板,取不同濃度的引物和探針組合,以能給出最低Ct值和最高熒光強(qiáng)度的組合為最佳組合。反應(yīng)體系為25 μL:2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL,上下游引物終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8 μmol/L,rfbE、Flic探針終濃度為0.12、0.16、0.18、0.2 μmol/L,IAC探針終濃度為0.12、0.14、0.16、0.18 μmol/L,IAC添加量分別為102、103、104、105、106copies,ROX Ⅱ0.5 μL,模板DNA 50~100 ng,用ddH2O補足體系。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性 30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃延伸35 s,35 個循環(huán)。60 ℃時收集熒光。

    1.3.5 基于內(nèi)參的E. coli O157∶H7實時熒光定量PCR方法的特異性實驗

    根據(jù)1.3.4節(jié)中確立的最佳反應(yīng)條件,水作為空白對照,提取表1中E. coli O157∶H7和其他病原菌的基因組DNA進(jìn)行實時熒光PCR擴(kuò)增,通過觀察擴(kuò)增曲線驗證所建立的實時熒光定量PCR方法的特異性。

    1.3.6 基于內(nèi)參的E. coli O157∶H7實時熒光定量PCR方法的靈敏性和定量范圍

    1.3.6.1 靈敏性檢測

    將已知濃度的E. coli O157∶H7基因組DNA做10 倍梯度稀釋,質(zhì)量濃度范圍為102~10-4ng/μL,每個稀釋度各取1 μL為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,能得到擴(kuò)增曲線的最低質(zhì)量濃度即為該反應(yīng)體系檢測的最高靈敏度。

    1.3.6.2 定量范圍檢測

    將E. coli O157∶H7經(jīng)過夜純培養(yǎng)后,用滅菌PBS作10 倍梯度稀釋,并選擇105、106、1073個稀釋度進(jìn)行平板計數(shù),以此計算原始菌落數(shù)。在5×107~5×100CFM/mL范圍內(nèi)每個稀釋度各取1 mL菌液,用水煮法提取基因組DNA,用50 μL滅菌水溶解DNA,取1 μL為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

    1.3.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

    以E. coli O157∶H7基因組DNA為模板,擴(kuò)增rfbE、Flic靶基因,凝膠回收,連接到pMD19-T載體上,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取陽性克隆,將菌液送上海生工測序進(jìn)行鑒定。

    將鑒定正確的菌液提取質(zhì)粒,并測定濃度,計算對應(yīng)的拷貝數(shù),做10 倍列稀釋,最終至1 copy/μL,制成標(biāo)準(zhǔn)模板溶液,分別取1 μL作為模板進(jìn)行rfbE、Flic實時熒光定量PCR反應(yīng),通過不同Ct值和濃度,分別建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,最終得到線性方程。

    1.3.8 重復(fù)性和穩(wěn)定性實驗

    將E. coli O157∶H7純培養(yǎng)物按10 倍梯度稀釋,取4 個稀釋度的樣本分別作3 個重復(fù),用以上建立的方法在ABI7500進(jìn)行擴(kuò)增檢測,計算Ct值的變異系數(shù),評價實驗結(jié)果的重復(fù)性。同時對本研究建立的方法,將試劑配制成試劑盒,考察試劑盒在-20 ℃條件下儲存6 個月后的穩(wěn)定性。

    1.3.9 對人工模擬污染樣本的檢測實驗

    將E. coli O157∶H7經(jīng)過夜純培養(yǎng)后,用滅菌PBS做10 倍系列稀釋,選取105、106、107稀釋度作平板計數(shù),計算純培養(yǎng)的初濃度。經(jīng)稀釋后,選取5~50 CFM的初始菌量分別添加到25 g生豬肉、生牛肉和生羊肉樣品(已按GB 4789.36—2008《食品衛(wèi)生微生物檢驗大腸埃希氏菌O157∶H7/NM檢驗》[17]檢測為E. coli O157∶H7陰性)中,再添加到225 mL增菌肉湯中,同時做空白對照(加1 mL生理鹽水)。將上述人工污染樣品進(jìn)行37 ℃,150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)。前增菌后6、8、10 h,分別取培養(yǎng)液1 mL,采用2 種方法進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA提取,取3 μL作為模板進(jìn)行檢測。本實驗進(jìn)行3 次重復(fù),同時與GB 4789.36—2008方法進(jìn)行比較。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 基于內(nèi)參的E. coli O157∶H7實時熒光定量PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化

    選擇熒光信號最強(qiáng),且曲線出現(xiàn)最早的引物探針組合為最佳引物探針濃度。當(dāng)引物為0.6 μmol/L,靶基因探針為0.18 μmol/L,IAC探針濃度為0.18 μmol/L時,熒光信號最強(qiáng),出現(xiàn)曲線最早,確定為最佳工作濃度。當(dāng)IAC的添加量為104copies時,既能出現(xiàn)明顯的CY5信號(Ct值小于25),又不會對rfbE和Flic的檢測有明顯影響。

    2.2 基于內(nèi)參的E. coli O157∶H7實時熒光定量PCR的特異性

    對E. coli O157∶H7和其他細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行檢測,結(jié)果rfbE和Flic引物探針僅對E. coli O157∶H7基因組DNA為陽性擴(kuò)增,呈現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線,對其他菌株均無擴(kuò)增曲線,顯示較好的特異性。同時所有反應(yīng)中IAC均擴(kuò)增良好。結(jié)果說明在反應(yīng)體系中添加104copies IAC對rfbE和Flic靶基因擴(kuò)增的特異性以及整個反應(yīng)體系均沒有任何影響,IAC可以有效地指示假陰性,同時保證結(jié)果的可靠性。結(jié)果如圖1所示。

    圖1 E. coli O157 H7實時熒光定量PCR的特異性Fig.1 Specifi city of the real-time qPCR

    2.3 E. coli O157∶H7實時熒光定量PCR的靈敏性

    圖2 E. coli O157 H7實時熒光定量PCR的靈敏性Fig.2 Sensitivity of the real-time qPCR

    以10 倍梯度稀釋的E. coli O157∶H7基因組DNA為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測,在102~10-3ng范圍內(nèi)均出現(xiàn)特異性擴(kuò)增,說明對基因組DNA的檢測靈敏度為10-3ng,即1 pg,結(jié)果如圖2A所示。

    以水煮法提取不同濃度細(xì)菌的基因組DNA為模板進(jìn)行檢測,在5×107~5×103CFM/mL范圍內(nèi)均出現(xiàn)特異性擴(kuò)增,表明該方法對于水煮法提取的DNA均可檢測,對E. coli O157∶H7的檢測限為5×103CFM/mL。結(jié)果如圖2B所示。

    2.4 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

    rfbE實時熒光定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=-3.193 lgX+37.435,反應(yīng)效率為1.056,R2為0.999,接近1;Flic實時熒光定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=-3.270 lgX+42.133,反應(yīng)效率為 1.022,R2為0.999,接近1;結(jié)果表明不同濃度模板拷貝數(shù)的對數(shù)與Ct值均呈良好的線性關(guān)系,最低檢測極限可以達(dá)到103copies/μL。

    2.5 重復(fù)性和穩(wěn)定性

    重復(fù)性實驗結(jié)果表明,重復(fù)實驗Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差均小于1,Ct值變異系數(shù)小于5.0%,說明檢測結(jié)果重復(fù)性好。穩(wěn)定性實驗結(jié)果顯示,本方法配制的檢測試劑在-20 ℃保存6 個月后,靈敏性和定量范圍不變,穩(wěn)定性良好。

    2.6 對E. coli O157∶H7人工污染樣品的檢測結(jié)果

    圖3 對人工污染生肉樣品中E. coli O157 H7的檢測Fig.3 Amplifi cation curves for E. coli O157∶H7 in artifi cially contaminated meat samples

    檢測結(jié)果表明,采用水煮法提取人工污染樣品中E. coli O157∶H7 DNA時,當(dāng)樣本中接菌量為7 CFM/25 g,增菌時間為10 h時,反應(yīng)體系IAC擴(kuò)增均為陽性,細(xì)菌可檢出。采取水洗加試劑盒法提取人工污染樣品中E. coliO157∶H7 DNA時,當(dāng)樣本中接菌量為7 CFM/25 g,增菌時間為6 h時,反應(yīng)體系中IAC擴(kuò)增均為陽性,細(xì)菌可檢出。傳統(tǒng)培養(yǎng)方法結(jié)果表明,3 次重復(fù)實驗的人工污染樣品均檢出E. coli O157∶H7,表明本研究建立的實時熒光定量PCR方法與傳統(tǒng)方法檢測結(jié)果相一致,結(jié)果如圖3所示。

    本研究建立的O157∶H7實時熒光定量PCR方法,采取水洗加試劑盒法提取DNA,在樣品經(jīng)6 h增菌后,即可從起始菌量為0.28 CFM/g生肉中檢測到E. coli O157∶H7。而采用水煮法提取DNA時,則需要至少10 h增菌才能從起始菌量為0.28 CFM/g生肉中檢測到E. coli O157∶H7。在樣品6~10 h增菌后,不同DNA提取方法的檢測結(jié)果見表3,Ct值均為3 次實驗的平均值。

    表3 對人工污染生肉樣品中E. coli O157 H7的檢測結(jié)果Table3 Detection results of E. coli O157 H7 in artififi cially contaminated meat samples

    33 討 論

    熒光定量PCR技術(shù)具有靈敏度高、重復(fù)性好、反應(yīng)高效、準(zhǔn)確性高、檢測周期短等優(yōu)點[18],已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域[19]。本研究選取E. coli O157∶H7特異性靶基因rfbE和Flic設(shè)計探針和引物,通過在反應(yīng)體系中添加IAC,利用靶基因和IAC的同時擴(kuò)增來防止假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。IAC在反應(yīng)體系中可以監(jiān)控PCR抑制、實驗操作的錯誤等。如果實際樣品檢測過程中出現(xiàn)靶基因檢測為陰性,而IAC也沒有擴(kuò)增信號,說明整個實驗不成立,PCR反應(yīng)是無效的,存在PCR反應(yīng)抑制物[20]等,需要查找原因重新進(jìn)行檢測,以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。同時為滿足出入境口岸“檢得出、檢得快、檢得準(zhǔn)”的迫切需求,本研究設(shè)置35 個循環(huán),以達(dá)到快速檢測大批量樣品的目的,彌補傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的不足。

    E. coli O157∶H7實時熒光定量PCR的R2與擴(kuò)增效率決定熒光定量的檢測能力[21]。本實驗建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值與拷貝數(shù)的對數(shù)呈良好的線性關(guān)系。反應(yīng)的靈敏性和定量范圍的結(jié)果顯示,無論反應(yīng)中是否加入104copies IAC,模板濃度與Ct值均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,靈敏度和定量均不受影響。模擬污染樣品檢測結(jié)果顯示,采取水洗加試劑盒法提取E. coli O157∶H7 DNA時,對于初始菌量為0.28 CFM/g的生肉樣品,前增菌6 h后均能檢測到靶基因。采取水煮法提取DNA時,對于初始菌量為0.28 CFM/g的生肉樣品,前增菌10 h后才能檢測到靶基因。對于兩種細(xì)菌DNA提取方法,不同增菌時間、不同初始添加量時的檢測反應(yīng)中,IAC內(nèi)參均出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線。在實際樣品檢測時,如果采用水煮法提取E. coli O157∶H7 DNA,建議前增菌時間大于10 h。

    本研究對兩種細(xì)菌DNA提取方法對實時熒光PCR檢出限的影響分析表明,對于不同初始菌量的樣品,采用試劑盒方法提取DNA時,前增菌6 h后均能檢出;而采用水煮法提取DNA時,則至少需要前增菌10 h才能檢出。兩種DNA提取方法的最低檢出限均為0.28 CFM/g,同時所有反應(yīng)體系中IAC均出現(xiàn)典型擴(kuò)增,表明兩種方法提取細(xì)菌DNA作為模板均可采用。水煮法花費時間稍長,費用低,而水洗加試劑盒方法提取的核酸純度較水煮法高,雜質(zhì)少,經(jīng)多次實驗證明該方法對于肉制品中其他致病菌DNA的提取同樣適用,尤其是比較復(fù)雜的基質(zhì)樣品,方法可靠,可以進(jìn)行推廣和應(yīng)用。因而在實際樣品檢測中,建議根據(jù)針對不同基質(zhì)樣品和食品檢測需求選擇提取方法[22]。

    研究[23-25]表明,一個可靠、有效的食源性致病菌檢測方法必須包含有可以指示假陰性結(jié)果的擴(kuò)增內(nèi)參,從而確保結(jié)果的可靠性。本實驗所建立的E. coli O157∶H7實時熒光定量方法,既能有效檢測食品中E. coli O157∶H7,又能實時監(jiān)測PCR反應(yīng)過程,有效防止“假陰性”的發(fā)生。同時對兩種不同樣品DNA提取方法的比較有效推動了E. coli O157∶H7實時熒光定量PCR檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化。

    [1] ZHAO Suhui, ZHOU Ying, WANG Chunhui, et al. The N-terminal domain of EspF induces host cell apoptosis after infection with enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7[J]. PLoS One, 2013, 8(1): e55164.

    [2] ATEBA C N, MBEWE M. Detection of Escherichia coli O157:H7 virulence genes in isolates from beef, pork, water, human and animal species in the northwest province, South Africa: public health implications[J]. Research in Microbiol, 2011, 162(3): 240-248.

    [3] GORDILLO R, RODRIGΜEZ A, MARIA L, et al. Quantifi cation of viable Escherichia coli O157:H7 in meat products by duplex real-time PCR assays[J]. Meat Science, 2014, 96: 964-970.

    [4] NEIL K P, BIGGERSTAFF G, MACDONALD J K, et al. A novel vehicle for transmission of Escherichia coli O157:H7 to humans: multistate outbreak of E. coli O157:H7 infections associated with consumption of ready-to-bake commercial prepackaged cookie dough-Μnited States, 2009[J]. Clinical Infectious Diseases, 2012, 54(40): 511-518.

    [5] SLAYTON R B, TURABELIDZE G, BENNETT S D, et al. Outbreakof Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) O157:H7 associated with romaine lettuce consumption, 2011[J]. PLoS One, 2013, 8(2): e5530.

    [6] 劉占通, 李金磊. 大腸桿菌O157:H7檢測方法的研究進(jìn)展[J]. 中國畜禽種業(yè), 2012(1): 48-50.

    [7] 李洪衛(wèi), 景懷琦, 逢波, 等. 徐州市2000年腸出血性大腸埃希菌O157:H7感染性腹瀉的調(diào)查[J]. 中華流行病學(xué)雜志, 2002, 23(2): 119-122.

    [8] 張建華, 陸群英, 程蘇云, 等. 實時PCR在大腸桿菌O157:H7快速檢測中的應(yīng)用[J]. 中國人獸共患病學(xué)報, 2007, 23(8): 839-842.

    [9] 侯鳳伶, 申志新, 申玉學(xué), 等. 河北省食源性致病菌監(jiān)測網(wǎng)的建立與主動監(jiān)測結(jié)果分析[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2008, 18(2): 225-228.

    [10] 王燕梅, 喬昕, 袁寶君, 等. 2006—2009年江蘇省食品中食源性致病菌的監(jiān)測分析[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志, 2010, 22(5): 431-432.

    [11] 胡慧, 陳雅君, 段志剛, 等. 大腸埃希氏菌O157:H7特異基因的實時熒光定量PCR檢測[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(12): 278-282.

    [12] 姜彥君, 都啟晶, 趙宏坤. 食源性致病菌多重PCR檢測方法的建立與應(yīng)用[J]. 中國食品學(xué)報, 2013, 13(10): 162-169.

    [13] SMO B, HE Y, TM S I, et al. A multiplex real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of Salmonella spp., Escherichia coli O157, and Listeria monocytogenes in meat products[J]. Foodborne Pathogens and Disease, 2010, 7(6): 619-628.

    [14] SINGH J, BATISH V K, GROVER S. A molecular beacon-based duplex real-time polymerase chain reaction assay for simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7 and Listeria monocytogenes in milk and milk product[J]. Foodborne Pathogens and Disease, 2009, 6(10): 1195-1201.

    [15] YANG X, CHENG H W, CHEN L. A duplex SYBR Green Ⅰ real-time quantitative PCR assay for detecting Escherichia coli O157:H7[J]. Genetics and Molecular Research, 2013, 12(4): 4836-4845.

    [16] SIEBERT P D, LARRICK J W. PCR MIMICS: competitive DNA fragments for use as internal standards in quantitative PCR[J]. Biotechnique, 1993, 14(2): 244-249.

    [17] 衛(wèi)生部. GB/T 4789.36—2008 食品衛(wèi)生微生物檢驗大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008.

    [18] 王立均, 許恒毅, 熊勇華, 等. 熒光定量PCR在大腸桿菌O157:H7檢測中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(11): 358-362. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201311075.

    [19] 王培育, 周梅. 腸出血性O(shè)157:H7檢測技術(shù)進(jìn)展[J]. 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 34(19): 2570-2572.

    [20] BONCRISTIANI H, LI Jilian, EVANS J D, et al. Scientifi c note on PCR inhibitors in the compound eyes of honey bees, apis mellifera[J]. Apidologie, 2011, 42(2): 457-460.

    [21] 蘇裕心, 高珊, 康琳, 等. 熒光定量PCR快速檢測金黃色葡萄球菌方法的建立[J]. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊, 2010, 34(1): 25-29.

    [22] 周陽, 祝長青, 郭云昌, 等. 不同食品基質(zhì)中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌核酸提取方法的比較[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報, 2013, 32(11): 1205-1211.

    [23] SI Xianming, LONG Fei, SUO Biao. Molecular methods for the detection and characterization of foodborne pathogens[J]. Pure and Applied Chemistry, 2010, 82(1): 69-79.

    [24] HOORFAR J, MALOMY B, ABDMLMAWJOOD A, et al. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2004, 42(5): 1863-1868.

    [25] HOORFAR J, COOK N, MALOMY B, et al. Making internal amplification control mandatory for diagnostic PCR[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2003, 41(12): 5835.

    Development of Real-Time Quantitative PCR Assay for the Detection of E. coli O157:H7 Based on Internal Amplifi cation Reference

    WANG Jianchang, WANG Jinfeng, DUAN Yongsheng, LI Jing, CHEN Zhimin, CHEN Ruichun*
    (Technology Center of Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shijiazhuang 050051, China)

    Based on the rfbE and Flic genes of Escherichia coli O157:H7, the specifi c primers and probes were designed, and a real-time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR) was developed. An internal amplification control (IAC) was added to the reaction system to monitor the performance of reaction system. The assay could be used reliably to detect E. coli O157:H7 genomic DNA with a sensitivity of 1 pg/μL. For the plasmid with rfbE and Flic, the limit of detection (LOD) reached 103copies/μL. The LOD for E. coli O157:H7 was 5 × 103CFM/mL using the DNA extracted by water boiling as the template. Through the standard curves of rfbE and Flic, the quantifi cation was linear between Ct values and the copy number of template (R2= 0.999). For artifi cially contaminated meat samples with an initial bacterial concentration of 7 CFΜ/25 g, the E. coli O157:H7 could be detected after 6 hours of culture using the DNA extracted by a commercial kit. Using the DNA extracted through water boiling, the E. coli O157:H7 could be detected after 10 hours of culture. The fl uorescence quantitative PCR assay could be applied to detect E. coli O157:H7 in food samples and monitor the PCR reaction process without false negative results. Furthermore, the comparison results of two different DNA extraction methods were helpful to standardize the RT-qPCR method for E. coli O157:H7.

    E.coli O157:H7; rfbE; Flic; real-time quantitative PCR; internal amplifi cation control (IAC)

    R155.5

    A

    1002-6630(2015)20-0226-06

    10.7506/spkx1002-6630-201520044

    2014-12-25

    質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(201210128;201310126)

    王建昌(1981—),男,獸醫(yī)師,博士,研究方向為食源性微生物、動物疫病病原的分子生物學(xué)檢測。

    E-mail:18630135980@163.com

    *通信作者:陳瑞春(1963—),男,研究員,學(xué)士,研究方向為食品安全項目。E-mail:crcde@163.com

    猜你喜歡
    內(nèi)參探針定量
    顯微定量法鑒別林下山參和園參
    內(nèi)參報道如何在全媒體時代“出圈”
    傳媒評論(2019年12期)2019-08-24 07:55:10
    當(dāng)歸和歐當(dāng)歸的定性與定量鑒別
    中成藥(2018年12期)2018-12-29 12:25:44
    辦好黨報內(nèi)參的思考與探索
    傳媒評論(2017年3期)2017-06-13 09:18:10
    10 種中藥制劑中柴胡的定量測定
    中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:35
    多通道Taqman-探針熒光定量PCR鑒定MRSA方法的建立
    BOPIM-dma作為BSA Site Ⅰ特異性探針的研究及其應(yīng)用
    內(nèi)參影響力與媒體公信力
    新聞傳播(2015年10期)2015-07-18 11:05:39
    慢性HBV感染不同狀態(tài)下HBsAg定量的臨床意義
    透射電子顯微鏡中的掃描探針裝置
    物理實驗(2015年9期)2015-02-28 17:36:47
    亚洲黑人精品在线| 国产精品偷伦视频观看了| 成人黄色视频免费在线看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 一级毛片我不卡| 99热全是精品| 国产精品国产av在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产精品亚洲av一区麻豆| 热re99久久国产66热| 免费看av在线观看网站| 国产一区二区三区综合在线观看| 婷婷色麻豆天堂久久| 午夜老司机福利片| 亚洲av片天天在线观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 人体艺术视频欧美日本| 午夜老司机福利片| 久久综合国产亚洲精品| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产一级毛片在线| 久热爱精品视频在线9| 老司机在亚洲福利影院| 国产精品一区二区在线不卡| 黑人猛操日本美女一级片| √禁漫天堂资源中文www| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产日韩欧美视频二区| 深夜精品福利| 亚洲人成电影免费在线| 精品久久久精品久久久| 国产精品久久久av美女十八| 免费观看人在逋| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 老司机在亚洲福利影院| 久久久欧美国产精品| av网站免费在线观看视频| 老司机午夜十八禁免费视频| av电影中文网址| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲精品一区蜜桃| 国产精品 欧美亚洲| 国产精品欧美亚洲77777| 777米奇影视久久| 欧美另类一区| 国产精品 欧美亚洲| 国精品久久久久久国模美| 免费日韩欧美在线观看| 一区二区三区激情视频| av天堂在线播放| 成人午夜精彩视频在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 咕卡用的链子| 一区二区三区激情视频| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美在线黄色| 亚洲人成网站在线观看播放| 深夜精品福利| 黄色一级大片看看| 天堂中文最新版在线下载| 嫁个100分男人电影在线观看 | 黄片播放在线免费| 不卡av一区二区三区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲精品自拍成人| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲欧美色中文字幕在线| 亚洲成人免费av在线播放| 一区二区三区激情视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 考比视频在线观看| 成人免费观看视频高清| 一级,二级,三级黄色视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 婷婷色综合www| 黄色 视频免费看| 久久久久久人人人人人| 午夜激情久久久久久久| 可以免费在线观看a视频的电影网站| svipshipincom国产片| 久久久久精品国产欧美久久久 | 成人手机av| 久久久久视频综合| 男男h啪啪无遮挡| 一区二区三区激情视频| 亚洲成色77777| 久久这里只有精品19| 色播在线永久视频| 男女午夜视频在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 一级毛片电影观看| 女性被躁到高潮视频| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲av国产av综合av卡| 女警被强在线播放| √禁漫天堂资源中文www| 国产免费一区二区三区四区乱码| 又紧又爽又黄一区二区| 欧美日韩亚洲高清精品| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲久久久国产精品| 满18在线观看网站| 免费在线观看黄色视频的| 国产片内射在线| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲欧洲日产国产| www.熟女人妻精品国产| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 日韩免费高清中文字幕av| 性色av一级| 久久国产亚洲av麻豆专区| 久久九九热精品免费| 欧美日韩综合久久久久久| 午夜福利,免费看| 午夜久久久在线观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲九九香蕉| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲av日韩在线播放| 国产成人精品在线电影| 性色av一级| 丁香六月欧美| 国产一区二区 视频在线| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 老司机亚洲免费影院| 国产高清视频在线播放一区 | av在线app专区| 午夜影院在线不卡| 水蜜桃什么品种好| 日本五十路高清| 九草在线视频观看| 日韩av不卡免费在线播放| 麻豆av在线久日| 91国产中文字幕| 夫妻午夜视频| 国产精品久久久久成人av| 老熟女久久久| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 一级毛片电影观看| 又黄又粗又硬又大视频| 欧美日韩黄片免| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产精品二区激情视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 亚洲三区欧美一区| 午夜免费观看性视频| 男女免费视频国产| 99热网站在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 老司机影院毛片| 亚洲精品国产一区二区精华液| 天堂俺去俺来也www色官网| 欧美激情极品国产一区二区三区| 午夜久久久在线观看| 亚洲av综合色区一区| 波野结衣二区三区在线| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 久久国产精品人妻蜜桃| 十八禁高潮呻吟视频| 99国产精品一区二区蜜桃av | 国产成人精品在线电影| 欧美大码av| 国产爽快片一区二区三区| 久久精品国产亚洲av高清一级| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 少妇粗大呻吟视频| 精品福利永久在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 日本wwww免费看| av电影中文网址| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 黑人猛操日本美女一级片| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲熟女毛片儿| 日本欧美视频一区| 亚洲av电影在线进入| 美女主播在线视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产成人精品无人区| 一边亲一边摸免费视频| 18禁观看日本| 丝袜人妻中文字幕| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲国产精品999| 成年人黄色毛片网站| 亚洲情色 制服丝袜| 久久久久久免费高清国产稀缺| 午夜免费观看性视频| 一级片免费观看大全| 午夜激情久久久久久久| 午夜福利影视在线免费观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久精品人人爽人人爽视色| 欧美日韩一级在线毛片| 国产1区2区3区精品| 久久久久久久国产电影| 国产淫语在线视频| 久久精品久久久久久久性| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 成人手机av| 国产成人a∨麻豆精品| 18禁观看日本| 黑丝袜美女国产一区| 首页视频小说图片口味搜索 | 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 国产男人的电影天堂91| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲图色成人| 国产男女超爽视频在线观看| 大码成人一级视频| netflix在线观看网站| 韩国精品一区二区三区| 久久中文字幕一级| 亚洲成国产人片在线观看| 黄色视频在线播放观看不卡| 人妻 亚洲 视频| 久久久亚洲精品成人影院| 国产人伦9x9x在线观看| 国产爽快片一区二区三区| 波野结衣二区三区在线| 99久久精品国产亚洲精品| 在线av久久热| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 久久av网站| 亚洲国产av新网站| 亚洲一区中文字幕在线| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 两个人看的免费小视频| 9热在线视频观看99| 欧美激情 高清一区二区三区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| www.熟女人妻精品国产| 久久久久久免费高清国产稀缺| 久久国产精品大桥未久av| 国产xxxxx性猛交| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 少妇粗大呻吟视频| 黄频高清免费视频| 国产高清国产精品国产三级| 纯流量卡能插随身wifi吗| 久久中文字幕一级| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产高清视频在线播放一区 | 亚洲国产欧美一区二区综合| 免费在线观看日本一区| 在线观看人妻少妇| 久久精品成人免费网站| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产在线观看jvid| 视频在线观看一区二区三区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 悠悠久久av| 日本a在线网址| 久久久精品94久久精品| 99热全是精品| 欧美日本中文国产一区发布| 在线av久久热| 亚洲精品第二区| 午夜福利免费观看在线| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 免费观看av网站的网址| 国产成人免费观看mmmm| 国产精品久久久久久精品电影小说| 韩国精品一区二区三区| 丝袜美腿诱惑在线| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 免费在线观看日本一区| 精品福利观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 性色av一级| videosex国产| e午夜精品久久久久久久| 五月天丁香电影| 精品人妻在线不人妻| 免费观看a级毛片全部| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 精品一区二区三卡| 亚洲国产欧美一区二区综合| 久久青草综合色| 国产爽快片一区二区三区| 一级片免费观看大全| 国产精品久久久久成人av| 午夜福利免费观看在线| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久av网站| 精品一区在线观看国产| 国产真人三级小视频在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 高清视频免费观看一区二区| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 好男人电影高清在线观看| 91国产中文字幕| 亚洲精品第二区| 美女大奶头黄色视频| 中文字幕精品免费在线观看视频| 黄频高清免费视频| 在现免费观看毛片| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲精品国产av成人精品| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 久久99热这里只频精品6学生| 国产欧美日韩一区二区三 | 啦啦啦在线免费观看视频4| 亚洲,欧美,日韩| 久久午夜综合久久蜜桃| 免费在线观看完整版高清| 伦理电影免费视频| 18禁国产床啪视频网站| 成人影院久久| 热99久久久久精品小说推荐| 中国国产av一级| 国产午夜精品一二区理论片| 搡老乐熟女国产| 亚洲人成网站在线观看播放| 男女国产视频网站| 亚洲第一青青草原| 黄色a级毛片大全视频| 免费在线观看完整版高清| 成人18禁在线播放| av天堂在线播放| 久久久久国内视频| 中出人妻视频一区二区| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产视频一区二区在线看| videosex国产| 美女扒开内裤让男人捅视频| 又紧又爽又黄一区二区| 国产一区二区激情短视频| 亚洲avbb在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产成人精品久久二区二区91| 看免费av毛片| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 欧美色视频一区免费| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 91成人精品电影| 亚洲人成伊人成综合网2020| 此物有八面人人有两片| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲精品国产区一区二| 后天国语完整版免费观看| 身体一侧抽搐| 精品欧美国产一区二区三| 999精品在线视频| 91国产中文字幕| 妹子高潮喷水视频| 日韩有码中文字幕| 99国产极品粉嫩在线观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产av在哪里看| 两人在一起打扑克的视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区 | 日日干狠狠操夜夜爽| 国产免费男女视频| 亚洲国产精品成人综合色| 免费无遮挡裸体视频| 色播亚洲综合网| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| a级毛片在线看网站| 激情在线观看视频在线高清| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 久久久国产成人精品二区| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲精品国产一区二区精华液| 久热这里只有精品99| 国产高清videossex| 宅男免费午夜| 免费在线观看日本一区| 亚洲av电影在线进入| netflix在线观看网站| 免费在线观看完整版高清| 色综合欧美亚洲国产小说| 午夜a级毛片| www.熟女人妻精品国产| 欧美黑人欧美精品刺激| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 在线免费观看的www视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产成人影院久久av| 国产亚洲精品一区二区www| 国产精品亚洲美女久久久| 国产av一区二区精品久久| 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美亚洲日本最大视频资源| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 中文资源天堂在线| 美女高潮到喷水免费观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 午夜a级毛片| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 妹子高潮喷水视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 视频区欧美日本亚洲| 最近最新中文字幕大全电影3 | a级毛片在线看网站| 在线观看舔阴道视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 一本综合久久免费| cao死你这个sao货| 国产精品亚洲美女久久久| АⅤ资源中文在线天堂| 在线视频色国产色| 欧美在线一区亚洲| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 亚洲av成人av| 美女扒开内裤让男人捅视频| 婷婷精品国产亚洲av在线| 久久久久国内视频| 亚洲专区字幕在线| 不卡一级毛片| 欧美+亚洲+日韩+国产| 一个人观看的视频www高清免费观看 | aaaaa片日本免费| 欧美三级亚洲精品| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 老司机深夜福利视频在线观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 大香蕉久久成人网| 好男人电影高清在线观看| aaaaa片日本免费| 美女午夜性视频免费| 伦理电影免费视频| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲午夜理论影院| 色播亚洲综合网| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 美女 人体艺术 gogo| 午夜福利18| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产91精品成人一区二区三区| 成人一区二区视频在线观看| 制服丝袜大香蕉在线| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产亚洲av嫩草精品影院| 大型黄色视频在线免费观看| 精品欧美一区二区三区在线| 欧美激情 高清一区二区三区| 中文字幕av电影在线播放| 俄罗斯特黄特色一大片| 免费无遮挡裸体视频| 两性夫妻黄色片| 亚洲 国产 在线| 在线av久久热| 欧美午夜高清在线| 窝窝影院91人妻| 香蕉丝袜av| 少妇 在线观看| 中文字幕人妻熟女乱码| 欧美又色又爽又黄视频| bbb黄色大片| 91字幕亚洲| 黄色片一级片一级黄色片| 女性被躁到高潮视频| 久久婷婷成人综合色麻豆| 在线观看一区二区三区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产男靠女视频免费网站| 午夜激情福利司机影院| 国产爱豆传媒在线观看 | 成人三级黄色视频| 99精品久久久久人妻精品| 一进一出抽搐gif免费好疼| 午夜精品在线福利| 白带黄色成豆腐渣| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 黄色毛片三级朝国网站| 日本精品一区二区三区蜜桃| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 午夜免费观看网址| 国产精品一区二区免费欧美| 好男人电影高清在线观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 两人在一起打扑克的视频| 色哟哟哟哟哟哟| 在线观看免费日韩欧美大片| 日本黄色视频三级网站网址| 淫秽高清视频在线观看| 黄片播放在线免费| 国产一卡二卡三卡精品| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 精品国产超薄肉色丝袜足j| 后天国语完整版免费观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲无线在线观看| 怎么达到女性高潮| 91成人精品电影| 久久午夜亚洲精品久久| 又紧又爽又黄一区二区| 国产精品久久视频播放| 久久国产精品影院| 亚洲五月婷婷丁香| 757午夜福利合集在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 一级毛片高清免费大全| 嫩草影院精品99| 成人三级做爰电影| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久久国产成人免费| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 亚洲五月天丁香| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 91成年电影在线观看| 精品高清国产在线一区| 波多野结衣高清作品| 欧美一级a爱片免费观看看 | 免费高清在线观看日韩| 久久久久久久久中文| 国产一区二区激情短视频| 色综合婷婷激情| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 91九色精品人成在线观看| 亚洲人成77777在线视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 亚洲五月婷婷丁香| 悠悠久久av| 欧美日韩一级在线毛片| 日韩精品青青久久久久久| 国产97色在线日韩免费| 波多野结衣av一区二区av| 久久久国产成人精品二区| 久久中文看片网| svipshipincom国产片| 黄色女人牲交| 欧美大码av| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产激情欧美一区二区| 日韩精品免费视频一区二区三区| 成人国语在线视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 中文字幕最新亚洲高清| 欧美黄色片欧美黄色片| 精品一区二区三区av网在线观看| 丰满的人妻完整版| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产精品,欧美在线| 九色国产91popny在线| 黄片小视频在线播放| 国产精品电影一区二区三区| 日韩三级视频一区二区三区| 黑人操中国人逼视频| 制服丝袜大香蕉在线| 老司机在亚洲福利影院| 国产精品 国内视频| 一级黄色大片毛片| 中文字幕精品亚洲无线码一区 | 18美女黄网站色大片免费观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲五月婷婷丁香| 一级黄色大片毛片| 美女免费视频网站| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 精品国产美女av久久久久小说| 国产激情欧美一区二区| 亚洲第一av免费看| 亚洲成国产人片在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 日本在线视频免费播放| 天堂动漫精品| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 老汉色av国产亚洲站长工具| 免费在线观看日本一区| 午夜福利欧美成人| 国产真实乱freesex| 97碰自拍视频| 成年免费大片在线观看| 欧美在线黄色| www.熟女人妻精品国产| 在线天堂中文资源库| 国产片内射在线| 88av欧美| 免费在线观看日本一区| www.999成人在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 91成年电影在线观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 日韩av在线大香蕉| 国产精品免费视频内射| 国产亚洲av嫩草精品影院| 韩国精品一区二区三区| 中出人妻视频一区二区| 久久中文看片网|