超高效液相色譜法檢測(cè)藥桑椹中1-脫氧野尻霉素

蒲俊松，陳 虎，向仲懷，楊光偉*，何寧佳*

（家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

超高效液相色譜法檢測(cè)藥桑椹中1-脫氧野尻霉素

蒲俊松，陳 虎，向仲懷，楊光偉*，何寧佳*

（家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

建立超高效液相色譜測(cè)定新疆藥桑椹中1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）含量的方法。藥桑椹粉經(jīng)0.05 mol/L鹽酸提取，在pH 8.5的硼酸鹽緩沖液條件下，氯甲酸-9-芴基甲酯（9-fluorenylmethyl chloroformate，F(xiàn)MOC-Cl）與DNJ反應(yīng)生成具有紫外吸收的絡(luò)合物（DNJ-FMOC），然后采用超高效液相色譜-紫外檢測(cè)器測(cè)定。液相色譜條件為CORTECSTMC18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.5%醋酸（28∶72，V/V），在流速0.6 mL/min、柱溫28 ℃、檢測(cè)波254 nm條件下檢測(cè)。結(jié)果表明：DNJ與其他組分分離效果良好，方法檢出限為0.1 μg/mL（RSN=3），線性范圍在0.5～20 μg/mL，相關(guān)系數(shù)（r）為0.999 970，加標(biāo)回收率平均為106.4%。精密度實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)以及回收率實(shí)驗(yàn)表明，該方法穩(wěn)定可靠，可作為測(cè)定藥桑椹中DNJ含量的有效方法。

藥桑；1-脫氧野尻霉素；超高效液相色譜；紫外檢測(cè)

藥桑（Morus nigra Linn.）屬桑科桑屬黑桑種。藥桑起源于伊朗，16世紀(jì)在我國(guó)新疆等地開(kāi)始栽培，是我國(guó)唯一的黑桑種。目前也主要分布于新疆阿克蘇、和田、吐魯番和喀什等地區(qū)[1-4]。藥桑桑椹是維吾爾族歷代的民間藥材，具有降低血糖、血脂的功效[5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)藥桑椹具有降三高（高血糖、高血脂、高血壓）、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用[6-8]。藥桑椹中含有黃酮、多糖、生物堿等多種活性成分[9-10]，1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是一種主要存在于桑樹(shù)中的多羥基哌啶生物堿。其具有降血糖[11]、降血脂[12]、抗腫瘤[13]、抑制變形鏈球菌生長(zhǎng)[14]、抗病毒[15]等功效。

作為降血糖的重要活性成分，DNJ含量可以作為桑制品降血糖效果的質(zhì)量指標(biāo)，也是進(jìn)一步篩選富含DNJ的桑資源重要依據(jù)[16]，因而需要開(kāi)發(fā)一種可靠的DNJ檢測(cè)方法。目前，DNJ的檢測(cè)方法主要分為兩類(lèi)，一類(lèi)是碘-碘化鉀分光光度法[17]，該方法步驟少，所需試劑易得，儀器要求不高，但是精確度不高；另一類(lèi)是色譜法，又分為氣相色譜法[18]和液相色譜法，高效液相色譜法為常用分析方法。按照配備的檢測(cè)器不同，高效液相色譜法分為蒸發(fā)光散射檢測(cè)法[19]、熒光檢測(cè)法[20]、紫外檢測(cè)法[16]和質(zhì)譜檢測(cè)法[21]。除蒸發(fā)光散射檢測(cè)法精確度相對(duì)較差，其他3 種方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠。

近年來(lái)基于小顆粒填料、低系統(tǒng)體積及快速檢測(cè)等技術(shù)發(fā)展的超高效液相色譜法，具有快速高效、高分離度等特點(diǎn)[22]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品、藥物中各類(lèi)物質(zhì)的分析檢測(cè)。目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有采用超高效液相色譜法檢測(cè)桑樹(shù)中DNJ的方法報(bào)道。本研究通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，確定最佳儀器分析條件，建立了超高效液相色譜-紫外檢測(cè)器法測(cè)定藥桑椹中DNJ的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藥桑椹由新疆和田蠶研所提供，采自和田不同地區(qū)；果桑椹采自西南大學(xué)桑樹(shù)品種資源圃。材料于60 ℃烘干至質(zhì)量恒定，粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40 目篩，置干燥器中冷凍備用。

DNJ（純度≥98%，CAS：19130-96-2） 北京恒元啟天化工技術(shù)研究院；氯甲酸-9-芴基甲酯（9-fluorenylmethyl chloroformate，F(xiàn)MOC-Cl，純度≥99.0%，色譜純）、甘氨酸（純度≥99%） 美國(guó)Sigma公司；乙腈、甲醇、醋酸（均為色譜純） 美國(guó)Thermo Fisher Scientifi c公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；FA2004B電子天平 上海精天電子儀器有限公司；KQ-500DV數(shù)控超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；CT15RE冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；ACQUITY超高效液相色譜、I-Class色譜儀（配紫外檢測(cè)器及Empower 3工作站） 沃特世科技（上海）有限公司；GX-03 150 g功能粉碎機(jī) 浙江高鑫工貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的提取

精確稱(chēng)取待測(cè)桑椹粉1 g，加入50 mL 0.05 mol/L HCl溶液，混勻后30 ℃水浴超聲10 min，提取液在20 ℃條件下10 000×g離心5 min，收集上清液，沉淀物再按上述步驟重復(fù)提取1 次，合并上清液，超純水定容至100 mL，即得樣品提取液。

1.3.2 DNJ標(biāo)準(zhǔn)液的配制

取DNJ標(biāo)準(zhǔn)品一瓶（20 mg），用10 mL 0.05 mol/L HCl溶液溶解，搖勻配為2 mg/mL的DNJ標(biāo)準(zhǔn)液。用時(shí)將DNJ標(biāo)準(zhǔn)液配制成0.5、2、8、12、16、20 μg/mL備用。

1.3.3 DNJ的衍生化

取DNJ提取液（或DNJ標(biāo)準(zhǔn)液）100 μL于1.5 mL的離心管，加入0.4 mol/L硼酸鉀緩沖液（pH 8.5）100 μL，再加入5 mmol/L的FMOC-Cl（溶解于乙腈中）200 μL，混勻后，20 ℃水浴20 min，加入1 mol/L的甘氨酸100 μL中和剩余的FMOC-Cl終止反應(yīng)，加入1%的醋酸溶液100 μL使衍生物穩(wěn)定，而后加入超純水400 μL稀釋?zhuān)?.22 μm針頭式過(guò)濾器過(guò)濾，即得測(cè)試液。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：CORTECSTMC18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流動(dòng)相：乙腈-0.5%醋酸（28∶72，V/V）；流速：0.6 mL/min；柱溫：28 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇及其比例的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)比較乙腈和不同體積分?jǐn)?shù)醋酸溶液作為流動(dòng)相的分離效果，結(jié)果顯示較高的醋酸體積分?jǐn)?shù)能夠改善色譜峰的對(duì)稱(chēng)性，綜合考慮選擇乙腈-0.5%醋酸溶液作為色譜分析時(shí)的流動(dòng)相。DNJ衍生物為弱極性，隨著乙腈比例的降低，流動(dòng)相極性增加，洗脫能力變?nèi)?，目?biāo)物的保留時(shí)間也會(huì)隨之延長(zhǎng)，這有助于目標(biāo)物與雜質(zhì)的分離。當(dāng)乙腈-0.5%醋酸（50∶50，V/V）時(shí)，因雜質(zhì)干擾，目標(biāo)物不能有效的分離，最后逐漸降低乙腈的比例，能夠有效分離目標(biāo)物；當(dāng)乙腈-0.5%醋酸（28∶72，V/V）時(shí)，目標(biāo)物的峰形良好，分離度為3.4。因此流動(dòng)相比例選用乙腈-0.5%醋酸（28∶72，V/V）。

2.2 測(cè)試樣品的超高效液相色譜圖譜

圖1 DNJ標(biāo)準(zhǔn)品及藥桑椹提取液色譜圖Fig.1 Chromatograms of DNJ standard and black mulberry fruit sample

分別對(duì)DNJ標(biāo)準(zhǔn)品及桑椹提取液進(jìn)行超高效液相色譜分析。如圖1所示，圖1c中DNJ標(biāo)準(zhǔn)品有3 個(gè)主色譜峰，但在進(jìn)行衍生化反應(yīng)時(shí)，若只加FMOC-Cl，不加Gly和DNJ，則僅出現(xiàn)FMOC-OH色譜峰（圖1a）；只加Gly和FMOC-Cl進(jìn)行衍生化反應(yīng)，則只出現(xiàn)FMOC-OH和Gly-FMOC色譜峰（圖1b）；通過(guò)分析第1個(gè)色譜峰峰面積與DNJ標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度，發(fā)現(xiàn)其呈線性關(guān)系。由此可以斷定，圖1c中3 個(gè)色譜峰依次分別為DNJ-FMOC、FMOC-OH、Gly-FMOC。

2.3 DNJ的線性關(guān)系

將DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度梯度按1.3.3節(jié)的方法進(jìn)行衍生化反應(yīng)，反應(yīng)液在上述色譜條件下進(jìn)行超高效液相色譜-紫外檢測(cè)器分析，以色譜峰面積（y）與標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，DNJ的質(zhì)量濃度與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，經(jīng)回歸分析，二者的回歸方程為y=872x－13.1，相關(guān)系數(shù)r=0.999 970，方法檢出限為0.1 μg/mL（RSN=3）。

2.4 精密度和重復(fù)性

取同一供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定6 次，分別測(cè)定DNJ的峰面積值，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.32%（n=6），說(shuō)明本測(cè)定方法精密度符合要求。按1.3節(jié)方法操作取桑椹粉6 份，進(jìn)行超高效液相色譜分析，根據(jù)峰面積值，并對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的DNJ含量，如表1所示，6 次測(cè)定的平均含量為0.623 4 mg/g，其RSD為1.00%（n=6）。表明本方法的重復(fù)性良好。

表1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table1 Results of repeatability test

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取桑椹粉提取液進(jìn)行衍生化反應(yīng)，分別間隔0、4、8、16、24、48 h進(jìn)樣，共進(jìn)樣6 次。測(cè)定結(jié)果表明，DNJ-FMOC的峰面積基本一致，計(jì)算DNJ峰面積的RSD為2.40%（n=6）。實(shí)際上在室溫條件放置一周后再次測(cè)定，DNJ-FMOC的峰面積也無(wú)顯著變化。

2.6 加標(biāo)回收率

取測(cè)定過(guò)DNJ含量的桑椹粉6 份，每份0.5 g，分別加入0.4 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，按1.3節(jié)方法制備樣品液和進(jìn)行衍生反應(yīng)。超高效液相色譜分析測(cè)定DNJ含量，計(jì)算加標(biāo)回收率。如表2所示，測(cè)定發(fā)現(xiàn)平均加標(biāo)回收率為106.4%，RSD為2.43%。此結(jié)果表明，本測(cè)定方法符合加標(biāo)回收率的要求。

表2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 Results of recovery rate test

2.7 桑椹樣品DNJ含量測(cè)定

表3 7 種桑椹樣品中DNJ含量測(cè)定Table3 The contents of DNJ in seven cultivars of mulberry fruit (x± s) mg/g

表3 7 種桑椹樣品中DNJ含量測(cè)定Table3 The contents of DNJ in seven cultivars of mulberry fruit (x± s) mg/g

桑椹于田（2012.8）于田（2014.8）策勒和田縣藥桑王和田市5801長(zhǎng)江一號(hào)DNJ含量0.610 3±0.011 0.672 9±0.010 1.038 3±0.014 1.384 5±0.013 1.501 9±0.019 2.524 7±0.026 1.138 8±0.013 0.792 0±0.009

對(duì)7 種桑椹中DNJ含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表3所示。前5 種都是藥桑椹，采自新疆不同地區(qū)，其中包括了2012年和2014年8月采于于田的藥桑椹。藥桑王為單棵，因其栽培歷史悠久而得名。5801和長(zhǎng)江一號(hào)兩種是果桑，采自西南大學(xué)桑樹(shù)品種資源圃。從表3可以看出，產(chǎn)自于田2012年和2014年的藥桑椹中DNJ含量相差不大，初步表明同一地區(qū)不同時(shí)間的藥桑椹中DNJ含量穩(wěn)定。而不同地區(qū)藥桑椹中DNJ的含量差異較大，其中和田市的含量最高，是于田的4 倍。和田縣、藥桑王和和田市的藥桑椹中DNJ的含量均高于劉凡[23]、肖明[24]等檢測(cè)桑葉、桑葉茶中DNJ的含量。Kimura等[25]研究表明DNJ給藥劑量為60 kg人體質(zhì)量6 mg時(shí)能夠抑制高血糖，和田市產(chǎn)藥桑椹DNJ含量為2.524 7 mg/g干質(zhì)量，按藥桑椹含水量80%[1]，每次食用12 g鮮果就能達(dá)到抑制高血糖的效果。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了超高效液相色譜-紫外檢測(cè)器測(cè)定藥桑椹中DNJ含量的方法。 目前已有不少關(guān)于桑樹(shù)中DNJ檢測(cè)方法的報(bào)道，大多為高效液相色譜法。與傳統(tǒng)的高效液相色譜相比，超高效液相色譜具有更快的分離速率、更高的分辨率和靈敏度[26]。高效液相色譜的方法不能完全適用于超高效液相色譜的分析，其中流動(dòng)相的比例對(duì)物質(zhì)的分離起著重要的作用。在本實(shí)驗(yàn)中，DNJ衍生物為弱極性，隨著乙腈和0.5%醋酸溶液比例的降低，流動(dòng)相的極性增強(qiáng)，洗脫能力減弱，分離能力變強(qiáng)，利于目標(biāo)物與雜質(zhì)的分離，但是檢測(cè)時(shí)間也更長(zhǎng)。即是如此，本方法也能在8 min內(nèi)完成檢測(cè)，相對(duì)于目前報(bào)道的最快速的DNJ檢測(cè)方法（12 min完成檢測(cè)）[20]，其檢測(cè)效率提高33%。當(dāng)流動(dòng)相比例為乙腈-0.5%醋酸（28∶72，V/V），DNJ峰形良好，分離度達(dá)到了3.4。且本方法流速低，能夠減少有機(jī)溶劑的消耗，進(jìn)樣量少，節(jié)省樣品。通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法具有良好的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性，能夠滿(mǎn)足分析要求。

隨著果汁類(lèi)飲料的風(fēng)行和以桑椹為原材料的功能性食品的開(kāi)發(fā)，DNJ作為該類(lèi)產(chǎn)品的主要功能性成分，其含量直接影響該類(lèi)產(chǎn)品的品質(zhì)。藥桑是新疆乃至中東地區(qū)獨(dú)特稀貴的藥用果桑種質(zhì)資源[1]，藥桑椹為維吾爾族歷代的民間藥材，具有很高的開(kāi)發(fā)價(jià)值，可作為新疆地區(qū)特有的果桑品種種植，對(duì)藥桑椹的開(kāi)發(fā)更能促進(jìn)新疆的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。近幾年關(guān)于桑葉中DNJ的研究報(bào)道較多，針對(duì)桑椹的DNJ含量及差異研究較少，本研究填補(bǔ)了這一空白，所建立的超高效液相色譜檢測(cè)藥桑椹中DNJ的方法，快速、簡(jiǎn)便、定量準(zhǔn)確，適合桑椹樣品中DNJ的快速定量檢測(cè)，為藥桑椹的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

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Determination of 1-Deoxynojirimycin in Black Mulberry Fruit by Ultra Performance Liquid Chromatography

PU Junsong, CHEN Hu, XIANG Zhonghuai, YANG Guangwei*, HE Ningjia*
(State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Chongqing 400715, China)

The contents of 1-deoxynojirimycin (DNJ) in the fruits of black mulberry (Morus nigra L.) were measured using ultra performance liquid chromatography (UPLC). Dried fruits were pulverized and extracted with 0.05 mol/L HCl, and then incubated with 9-fl uorenylmethyl chloroformate (FMOC-Cl) in pH 8.5 borate buffer to produce the complex DNJ-FMOC. The concentration of DNJ-FMOC was detected by UPLC coupled with UV detector. A CORTECSTMC18column was used and the column temperature was kept at 28 ℃. The mobile phase was acetonitrile-0.5% acetic acid solution (28:72, V/V) with a fl ow rate of 0.6 mL/min. The UV detection wavelength was 254 nm. The results indicated that DNJ was separated well with a linearity ranging from 0.5 to 20 μg/mL. The limit of detection (LOD) was 0.1 μg/mL and the correlation coeffi cient (r) between the peak area of DNJ-FMOC and DNJ concentration was 0.999 970 and the average recovery from spiked samples was 106.4%. The tests for precision, stability, reproducibility and recovery rate showed that the method was stable and reliable, and could be used as an effective method for the determination of DNJ content in black mulberry fruits.

Morus nigra L.; 1-deoxynojirimycin; ultra performance liquid chromatography; UV detection

TS207.5

A

1002-6630（2015）20-0207-04

10.7506/spkx1002-6630-201520040

2015-01-09

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2013AA100605）；國(guó)家農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)2003科研專(zhuān)項(xiàng)（201403064）

蒲俊松（1990—），男，碩士，研究方向?yàn)橹参锘瘜W(xué)。E-mail：466342842@qq.com

*通信作者：楊光偉（1958—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)橹参锷怼-mail：yanggw@swu.edu.cn

何寧佳（1971—），女，教授，博士，研究方向?yàn)楣δ芑蚪M與分析生物學(xué)。E-mail：hejia@swu.edu.cn