基于GC-MS和GC-O聯(lián)用法分析佛手精油關(guān)鍵香氣成分

楊 君，郜海燕，儲國海，李澤樺，牛云蔚，蔡 銘，胡安福，蔣 健,*

（1.浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，浙江 杭州 310009；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所，浙江 杭州 310021；3.浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 杭州 310014；4.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418）

基于GC-MS和GC-O聯(lián)用法分析佛手精油關(guān)鍵香氣成分

楊 君1，郜海燕2，儲國海1，李澤樺3，牛云蔚4，蔡 銘3，胡安福1，蔣 健1,*

（1.浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，浙江 杭州 310009；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所，浙江 杭州 310021；3.浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 杭州 310014；4.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418）

研究佛手精油的揮發(fā)性物質(zhì)和關(guān)鍵香氣成分。佛手經(jīng)水蒸氣蒸餾法提取精油，利用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）結(jié)合氣相色譜-嗅聞（gas chromatography-olfactometry，GC-O）技術(shù)對揮發(fā)性物質(zhì)和香氣成分進行分析。GC-MS-O檢測出36 種揮發(fā)性物質(zhì)，主要成分為D-檸檬烯（34.69%）、γ-松油烯（20.42%）、β-甜沒藥烯（4.59%）。采用稀釋法和強度法分析發(fā)現(xiàn)D-α-蒎烯、D-檸檬烯、β-芳樟醇、別羅勒烯、4-松油醇、α-佛手柑烯具有較大的香氣強度；D-α-蒎烯、β-蒎烯、β-羅勒烯、橙花乙酸酯、α-佛手柑烯具有較大風(fēng)味稀釋因子。綜合分析認為D-α-蒎烯和α-佛手柑烯是佛手精油的關(guān)鍵特征香味成分。

佛手精油；香氣成分；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；氣相色譜-嗅聞技術(shù)

佛手（Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle）是蕓香科柑橘屬植物香櫞的變種，為常綠小喬木，由于果實頂部張開呈指狀，因此得名[1]。佛手精油含量較高，主要存在于佛手果實的外果皮、中果皮中，色澤透明或淡黃色，具有清新怡人的特征香味，常作為高檔香料而廣泛應(yīng)用于食品、化妝品領(lǐng)域[2]。佛手精油具有較多生理活性功能，如治療胃痛、脅漲、嘔吐、痰飲咳嗽、解酒等[3]。佛手精油主要物質(zhì)是檸檬烯，此外還含有一定量γ-松油烯、β-蒎烯、β-月桂烯等物質(zhì)[4-5]。研究[6-8]表明，檸檬烯對大腸桿菌O157∶H7和腸炎沙門氏菌具有很強抑制作用，γ-松油烯對沙門氏菌具有較好抑菌活性。Peng等[4]發(fā)現(xiàn)佛手精油能促進胰島素分泌，可用于治療Ⅱ型糖尿病。Somrudee等[9]報道佛手精油具有抗焦慮效果。實驗證明，佛手揮發(fā)油對支氣管哮喘動物具有止咳、平喘、祛痰等治療作用[10]。此外，佛手精油還可改善情緒、應(yīng)激障礙等輕度癥狀[11]。目前，對佛手精油揮發(fā)性成分的研究已取得了眾多進展，但對其關(guān)鍵香氣成分的研究還尚屬空白。

氣相色譜-嗅聞（gas chromatography-olfactometry，GC-O）法是目前香氣成分分析的重要手段之一。GC-O是一種直觀的感官檢測方法，即通過人的鼻子直接嗅聞復(fù)雜的混合氣味從而篩選出具有氣味的化合物，并對氣味特征進行評價。GC-O可以發(fā)現(xiàn)食品中大量揮發(fā)性成分中真正具有氣味活性的成分和各氣味成分在不同濃度條件下對整體氣味的貢獻，在鑒別特征香味化合物、香味活性化合物等方面具有明顯的優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于食品、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域[12-16]。常用的GC-O檢測方法有稀釋法、強度法、檢測頻率法等[17]。稀釋法是將被分析物稀釋一定倍數(shù)，嗅辨師鑒定在哪個稀釋度條件下仍然能聞到，并描述該氣味。風(fēng)味稀釋因子（flavor dilution factor，F(xiàn)D）是氣味化合物能被感知的最大稀釋度，F(xiàn)D值高的物質(zhì)即被認為是重要的致香物質(zhì)。強度法是根據(jù)實際嗅聞到的氣味強度評價各化合物對整體香氣貢獻程度，化合物氣味強度越大，其對香氣整體貢獻就越大。

本實驗采用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）技術(shù)鑒定佛手精油中揮發(fā)性物質(zhì)，利用GC-O稀釋法和強度法評價各香氣成分對整體香味的貢獻，對佛手精油在食品藥品、香精香料領(lǐng)域中的應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金華佛手柑（2014年） 浙江金手寶生物科技有限公司；無水乙醇為色譜純，乙醚、無水硫酸鈉均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TRACE1300GC儀配有ISQ LT MS儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；Sniffer 9000嗅味檢測儀 瑞士Brechbühler公司。

1.3 方法

1.3.1 佛手精油的分離提取

取金華佛手柑果實切成1 cm×1 cm×1 mm片狀。按料液比1∶10（g/mL）加入蒸餾水，加熱至微沸，自沸騰起計時保持3 h，收集精油，加入一定量的Na2SO4至精油中，靜置過夜，過濾，用乙醚洗滌Na2SO4，并將洗滌液與濾液合并，用0.45 μm有機膜過濾精油，揮發(fā)除盡乙醚，得佛手脫水精油。

1.3.2 GC-MS分析條件

GC條件：DB-5 MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；分流比10∶1；進樣量1.0 μL；進樣溫度250 ℃；載氣為高純氦氣，純度大于99.999%；流量1.0 mL/min；程序升溫：50 ℃保持1 min，5 ℃/min升到130 ℃，保持0.5 min，15 ℃/min升到250 ℃，保持10 min。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度280 ℃；質(zhì)量掃描范圍50～500 u；用Mainlab譜庫檢索加以確認。各物質(zhì)相對含量采用峰面積歸一化法確定。

1.3.3 GC-O分析條件

GC-O系統(tǒng)由GC（配氫火焰離子檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID））和Sniffer嗅辨儀組成。

GC條件：DB-5 MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；分流比10∶1；進樣量1.0 μL；進樣溫度250 ℃；FID檢測器溫度為280 ℃；載氣為高純氦氣，純度大于99.999%，流量1.0 mL/min。程序升溫條件同GC-MS。氣相毛細管柱末端以分流比為1∶1分別連接FID檢測器和Sniffer嗅辨儀。GC柱箱與嗅辨儀傳輸線溫度220 ℃，在嗅覺端口處對氣體進行加濕，防止因氣體干燥引起嗅辨師不適。

嗅辨師經(jīng)專業(yè)訓(xùn)練，熟悉各種香味并掌握一定量術(shù)語描述香味與香氣特征。為避免嗅覺疲勞，每次嗅聞時間不超過40 min，且2 次嗅聞之間至少間隔30 min。實驗采用稀釋法和強度法，即嗅辨師在實驗過程中需描述聞到的氣味和強度。樣品逐級稀釋（分別稀釋50、100、200、400 倍等），直到嗅辨師聞不到氣味為止。每種香味化合物最高稀釋倍數(shù)即為FD值，氣味強度級別表示見表1。

表1 5 級氣味強度表示法[18]Table1 Descriptions of odor intensities[18]

2 結(jié)果與分析

樣品經(jīng)GC-MS分析，結(jié)果如表2所示，總離子流圖如圖1所示。共發(fā)現(xiàn)33 種物質(zhì)，其中烯烴類物質(zhì)16 種，相對峰面積占83.53%；醇類物質(zhì)6 種，相對峰面積占7.40%；酸類物質(zhì)3 種，相對峰面積占7.48%；酯類物質(zhì)3 種，相對峰面積占0.85%；酚類物質(zhì)2 種，相對峰面積占0.23%；醛類物質(zhì)2 種，相對峰面積占0.18%和烷烴物質(zhì)1 種，相對峰面積占0.31%。相對含量超過1%的物質(zhì)有D-檸檬烯（34.69%）、γ-松油烯（20.42%）、β-甜沒藥烯（4.59%）、月桂酸（2.98%）、α-松油醇（2.63%）、石竹烯（2.53%）、肉豆蔻酸（1.98%）、4-萜品醇（1.91%）、2-蒈烯（1.73%）、棕櫚酸（1.53%）、β-蒎烯（1.48%）、β-羅勒烯（1.26%）、大牻牛兒烯（1.23%）、D-α-蒎烯（1.20%）。結(jié)果與其他學(xué)者研究基本相符。陳麗君等[19]從橙油中檢測到35 種揮發(fā)性物質(zhì)，其中相對含量較高的化合物為檸檬烯（80.79%）、芳樟醇（3.85%）、癸醛（2.90%）、β-月桂烯（1.94%）、β-蒎烯（0.82%）等。金宏等[20]報道佛手揮發(fā)油中95%以上物質(zhì)是檸檬烯、1-甲基-（1-甲乙基）-苯、β-蒎烯和α-蒎烯。趙磊等[21]定性定量分析了12 種金華佛手的揮發(fā)油，鑒定出27 種化學(xué)成分，主要成分均是檸檬烯和γ-松油烯。檸檬烯通常是柑橘類精油中含量最高的物質(zhì)，相對含量可達60%～90%，相對含量與種植環(huán)境、成熟程度有關(guān)[22-25]。檸檬烯可作為用于掩蓋某些生物堿苦味的風(fēng)味改良劑或作為合成香芹酮的前體物質(zhì)。通過GC-O分析，共發(fā)現(xiàn)26 種物質(zhì)，其中有3 種風(fēng)味物質(zhì)（保留時間在3.35、3.90、27.70 min）并未在MS分析中檢測出，可能是相對含量低于MS的檢測限而沒有被檢測到。

表2 佛手精油GC-MS和GC-O分析結(jié)果Table2 Analytical results of fi nger citron essential oil by GC-MS-O

續(xù)表2

圖1 佛手精油GC-MS總離子流圖Fig.1 GC-MS TIC chromatogram for fi nger citruon essential oil

圖2 佛手精油的強度法（A）和稀釋法（B）圖譜Fig.2 GC-MS-O analysis of fi nger citron essential oil

由圖2A可知，香氣強度值最大的物質(zhì)為D-α-蒎烯（強度值為4），其他較大的物質(zhì)有D-檸檬烯（強度值為3）、β-芳樟醇（強度值為3）、別羅勒烯（強度值為3）、4-萜品醇（強度值為3）、α-佛手柑烯（強度值為3），說明它們是佛手精油香味的重要成分。由圖2B可知，在稀釋法中，D-α-蒎烯、β-蒎烯、β-羅勒烯、橙花乙酸酯、α-佛手柑烯FD值都達到400，說明它們在濃度極低的情況下仍可提供強烈的香氣，被認為對佛手精油香味的影響非常大。物質(zhì)氣味強度和濃度之間存在一定關(guān)系，Kamadia等[26]采用稀釋法證實了物質(zhì)氣味強度和濃度之間滿足Steven’s Law定律。因此，稀釋法可以彌補強度法的缺陷，二者優(yōu)勢互補，更有利于把握佛手精油中的關(guān)鍵致香物質(zhì)。佛手精油整體嗅香主要表現(xiàn)為清香、甜香、果香為主體的香韻，經(jīng)過嗅辯師反復(fù)聞香鑒定，強度和稀釋度均為最大的D-α-蒎烯表現(xiàn)出強烈的清甜果香，與精油的頭香果香味很相似，確定為佛手精油的主體香韻，α-佛手柑烯表現(xiàn)為清甜香、柑橘香，也與佛手的香韻非常相似。而其他物質(zhì)的香氣強度或濃度未達到主體香的要求，故確定D-α-蒎烯和α-佛手柑烯是佛手精油的特征香味，即佛手精油的關(guān)鍵致香物質(zhì)。以上分析也說明，各化合物是否是關(guān)鍵致香物質(zhì)，不能僅靠單一的方法來進行判斷，稀釋法和強度法結(jié)合可以更有效的鑒別精油的關(guān)鍵致香物質(zhì)。

對比GC-MS和GC-O分析，D-檸檬烯和γ-松油烯相對含量雖然較高，但FD值較小，說明其對佛手精油的整體香氣影響較小，從結(jié)果可以看出，對佛手精油香味貢獻大的物質(zhì)相對含量并不一定大，僅從相對含量來比較不同成分對香味的貢獻是不準確的，需要結(jié)合閾值才能得出更真實的結(jié)果。

3 結(jié) 論

利用GC-MS和GC-O鑒定出佛手精油中揮發(fā)性成分和香氣物質(zhì)36 種。佛手精油主要成分是D-檸檬烯（34.69%）、γ-松油烯（20.42%）、β-甜沒藥烯（4.59%）等。佛手精油中烯烴相對含量占到大部分，達83.53%，酸類、醇類、酯類、酚類、醛類和烷烴分別占到總相對含量的7.48%、7.40%、0.85%、0.23%、0.18%和0.31%。嗅聞實驗中采用強度法和稀釋法結(jié)合的方法，發(fā)現(xiàn)D-α-蒎烯、D-檸檬烯、β-芳樟醇、4-松油醇、α-佛手柑烯具有較大的強度，D-α-蒎烯、β-蒎烯、β-羅勒烯、橙花乙酸酯、α-佛手柑烯具有較大FD值。綜合分析后確定D-α-蒎烯和α-佛手柑烯是佛手精油的特征香味。

近年來，食品風(fēng)味方面的研究越來越受到人們的重視，GC-O作為分析風(fēng)味物質(zhì)的有力工具，應(yīng)用越來越多，尤其是食品和飲料領(lǐng)域。本實驗利用GC-MS-O聯(lián)用方法，快速準確地篩選出香氣中關(guān)鍵致香物質(zhì)，為佛手精油在食品藥品、添香領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論參考，并為香精香料進一步研究開發(fā)提供新的思路。

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Characterization of Volatile Constitutes and Odorous Compounds in Essential Oil of Finger Citron(Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle) by GC-MS and GC-O

YANG Jun1, GAO Haiyan2, CHU Guohai1, LI Zehua3, NIU Yunwei4, CAI Ming3, HU Anfu1, JIANG Jian1,*
(1. China Tobacco Zhejiang Industrial Co. Ltd., Hangzhou 310009, China; 2. Institute of Food Science, Zhejiang Acadmy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China; 3. College of Ocean, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China; 4. Shanghai Institute of Technology, School of Perfume and Aroma Technology, Shanghai 201418, China)

The volatile constitutes and odorous compounds in essential oil of finger citron (Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle) were evaluated. The oil was extracted by hydrodistillation and analyzed by gas chromatographymass spectrometry (GC-MS) and gas chromatography-olfactometry (GC-O). A total of 36 compounds in the oil were identifi ed, among which, D-limonene (34.69%), γ-terpinene (20.42%), and β-bisabolene (4.59%) were the main compounds. D-α-pinene, D-limonene, β-linalool, allo-ocimene, terpin-4-ol and α-bergamotene displayed strong aromatic intensity, while D-α-pinene, β-pinene, β-ocimene, neryl acetate and α-bergamotene showed relatively higher fl avor dilution (FD) factor. The results demonstrated that D-α-pinene and α-bergamotene were the key contributors to the characteristic aroma of fi nger citron oil.

finger citron essential oil; odorous compounds; gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS); gas chromatography-olfactometry (GC-O)

TS255.1

A

1002-6630（2015）20-0194-04

10.7506/spkx1002-6630-201520037

2015-02-15

楊君（1972—），男，高級工程師，碩士，研究方向為天然植物提取、感官組學(xué)。E-mail：yangjun@zjtobacco.com

*通信作者：蔣?。?978—），男，高級工程師，碩士，研究方向為香精香料化學(xué)分析。E-mail：jiangj@zjtobacco.com