高效液相色譜-紫外檢測器法測定高脂飲食小鼠血清中槲皮素含量

邊會喜，蔡 靜，吳澤宇，張 弦，劉 健

（1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.合肥工業(yè)大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009）

高效液相色譜-紫外檢測器法測定高脂飲食小鼠血清中槲皮素含量

邊會喜1，蔡 靜1，吳澤宇2，張 弦1，劉 健1

（1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.合肥工業(yè)大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009）

目的：建立用高效液相色譜-紫外檢測器檢測法測定飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠血清中槲皮素含量的方法。方法：色譜柱：Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.2%甲酸溶液（40∶60，V/V）；檢測波長：360 nm；柱溫：30 ℃；流速：0.50 mL/min。結(jié)果：槲皮素在2.5～40 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 1），平均回收率為96.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為10.98%（n=5）。結(jié)論：該方法具有良好的回收率和重復(fù)性。可以對血清中的槲皮素實現(xiàn)簡便、快速、準(zhǔn)確的檢測。

高效液相色譜法；紫外檢測器；高脂飲食；血清；槲皮素

槲皮素是一種典型的黃酮類物質(zhì)，并且廣泛分布在植物中，大多以甙的形式存在，經(jīng)水解后可得槲皮素[1-2]。目前已經(jīng)證實槲皮素具有多種對人體健康有益的生物功能，包括抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗血小板凝集等活性[3-7]。有體外實驗證明槲皮素能夠有效地改善肥胖和相關(guān)的胰島素抵抗[8-10]，另有研究證實槲皮素可以改善飲食誘導(dǎo)的肥胖模型、基因缺陷肥胖模型、化學(xué)誘導(dǎo)的糖尿病動物模型中胰島素敏感性[11-13]。因此，在研究槲皮素對飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠作用機(jī)制的過程中，為了對槲皮素進(jìn)行質(zhì)量濃度控制和穩(wěn)定性研究，本實驗采用高效液相色譜紫外檢測器法對高脂飲食添加槲皮素喂養(yǎng)的小鼠血清中槲皮素的質(zhì)量濃度進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品號：Sigma-Q4951，≥95%，HPLC）、β-葡萄糖醛酸酶（標(biāo)準(zhǔn)品號：Type HP-2）；乙酸乙酯、甲醇、乙腈為色譜純、甲酸為分析純，水為高純水。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 Infinity高效液相色譜儀（配有紫外檢測器、ChemStation工作站）、Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱 美國安捷倫公司；QT-1型旋渦混合器 上海琪特分析儀器有限公司；PURELAB Classic純水儀 英國Elga公司；CT14RD高速冷凍離心機(jī) 上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司；MTN-2800D氮吹濃縮裝置 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；DHG-9101-2SA型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；FA1204B型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司。

1.3 動物培養(yǎng)及樣品采集

將5 周齡的C57BL/6小鼠分為兩組，每組8 只，分別喂養(yǎng)高脂飲食和添加0.1%槲皮素的高脂飲食，喂養(yǎng)12周。飲食配方如表1所示，其中高脂飲食基于“Research Diets D12451”，包含4.73 kcal/g和45%脂肪能量。在此基礎(chǔ)上配制高脂飲食添加0.1%槲皮素的飼料。

表1 實驗動物飲食配方表Table1 The composition of experimental diet

所有的小鼠都在SPF級動物房中飼養(yǎng)，溫度維持在25 ℃，并且循環(huán)維持12 h的光照和12 h的黑暗環(huán)境。小鼠可以自由的攝取水和食物。12 周以后小鼠禁食過夜，然用CO2窒息處死。血液從心臟中取出，4 ℃靜置過夜，然后在5 000×g離心15 min收集血清，于－80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 方法

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流動相：乙腈-0.2%甲酸溶液（40∶60，V/V）；流速：0.5 mL/min；檢測波長：360 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.4.2 對照品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取槲皮素對照品10.0 mg置于50 mL容量瓶中，用甲醇使其溶解并定容至刻度，搖勻，得200 μg/mL槲皮素對照品溶液。使用時根據(jù)需要稀釋至質(zhì)量濃度2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL。

1.4.3 樣品溶液的配制

將血清從－80 ℃取出，在室溫條件下融解，每個樣品取樣100 μL，加入10 μL抗壞血酸（0.1 mol/L）、100 μL高純水及250 μL醋酸鈉緩沖液（100 mmol/L，pH 5.0），簡單混合后加入β-葡萄糖醛酸酶（HP-2型）（10 000 U），使用旋渦混合器混勻，置于37 ℃水浴中培養(yǎng)6 h。再使用2 mL的乙酸乙酯反復(fù)萃取3次。取乙酸乙酯部分并吹干，再用80 μL的95%的甲醇溶解，旋渦振蕩。5 000 r/min離心6 min后待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的確定

槲皮素在360 nm波長條件下色譜峰的峰形和檢測靈敏度符合檢測要求，結(jié)合參考文獻(xiàn)[14-15]，最終確定360 nm作為檢測波長。

2.2 流動相的選擇

分別采用不同比例的甲醇-乙腈-磷酸、甲醇-乙腈-水-磷酸、乙腈-磷酸、乙腈-甲酸溶液為流動相[16-19]，對樣品的分離情況進(jìn)行考察，當(dāng)乙腈-0.2%甲酸（40∶60，V/V）時，槲皮素峰形較好。標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖1所示。

圖1 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 HPLC-UV chromatogram of quercetin standard solution

2.3 線性關(guān)系和精密度實驗

分別精密吸取5 組混合標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，從低質(zhì)量濃度到高質(zhì)量濃度進(jìn)樣，每組重復(fù)3 次，按色譜條件測定其峰面積，以對照品在混合標(biāo)液中的質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，得到的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測限（RSN=3）、定量限（RSN=10）見表2。從標(biāo)準(zhǔn)溶液中取槲皮素質(zhì)量濃度為10 μg/mL的一組溶液進(jìn)行了3 次重復(fù)測定，結(jié)果表明槲皮素的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.96%。

表2 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測限、定量限Table2 Linear equation with correlation coeffi cients and linear ranges, and limits of detection and quantitation

2.4 穩(wěn)定性

取20 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，在6 h內(nèi)每2 h進(jìn)樣1 次，進(jìn)樣量20 μL，測定槲皮素的峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.93%。結(jié)果表明：供試品溶液在6 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5 加標(biāo)回收率

取采用高脂飲食未添加槲皮素喂養(yǎng)的小鼠血清，分別添加不同量的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.4.3節(jié)方法制備加標(biāo)樣品溶液，按規(guī)定的色譜條件進(jìn)行測定，測定結(jié)果見表3。槲皮素平均回收率為96.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為10.98%（n=5）。

表3 方法回收率和精密度（n=5）Table3 Recovery and precision of the method (n = 5)

2.6 樣品含量測定結(jié)果

表4 高脂飲食添加槲皮素喂養(yǎng)的小鼠血清中槲皮素的測定結(jié)果（n=7）Table4 Contents of quercetin in serum of high fat diet (HFD)-fed mice ((n = 7))

圖2 小鼠血清色譜圖Fig.2 HPLC-UV chromatograms of mouse sera

將7 只高脂飲食添加槲皮素喂養(yǎng)的小鼠血清樣本制備好，手動進(jìn)樣，并按色譜條件平行進(jìn)行3 次測定，外標(biāo)法計算樣品中槲皮素的含量。測定結(jié)果見表4，樣品色譜圖見圖2。測定結(jié)果表明該方法具有良好的回收率和重復(fù)性，可以對血清中的槲皮素實現(xiàn)簡便、快速、準(zhǔn)確的檢測。

3 討 論

本實驗將高脂飲食誘導(dǎo)肥胖的小鼠飼料中添加槲皮素進(jìn)行喂養(yǎng)，采集血清，對其中的槲皮素含量進(jìn)行檢測。在制備樣品的過程中，為了防止槲皮素的氧化，加入抗壞血酸，并迅速檢測[20-21]。槲皮素作為一種醇溶性物質(zhì)，由于其結(jié)構(gòu)上具有酚羥基，可能會導(dǎo)致酚羥基電離成苷元陰離子造成峰拖尾現(xiàn)象，因此流動相應(yīng)偏酸性，以抑制離解，使色譜峰的峰形得到改善，因此流動相中加入甲酸[22-23]。有研究報道，大鼠灌胃槲皮素后的血漿中檢測不到槲皮素原形藥，而經(jīng)過徹底的酸水解后可檢測到槲皮素、異鼠李素等[24]。Graf等[25]發(fā)現(xiàn)，槲皮素經(jīng)過大鼠體內(nèi)代謝，血漿中產(chǎn)生大量的硫酸化的甲基槲皮素葡萄糖苷酸，說明血漿中的槲皮素以結(jié)合物的形式存在。因此采用β-葡萄糖醛酸酶水解后進(jìn)行檢測。而最終檢測樣品中目標(biāo)峰的拖尾現(xiàn)象應(yīng)該與槲皮素代謝物的水解有關(guān)，可用質(zhì)譜做進(jìn)一步的確認(rèn)。

本實驗建立了用高效液相色譜-紫外檢測器檢測法測定添加槲皮素的高脂飲食小鼠的血清中槲皮素的方法，并對其血清中所含的槲皮素含量進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，與相關(guān)報道的槲皮素質(zhì)量濃度在同一數(shù)量級內(nèi)[6-7]。本實驗考察了色譜檢測條件，同時對方法的精密度、穩(wěn)定性及加標(biāo)回收率等進(jìn)行了考察，結(jié)果表明該方法相對準(zhǔn)確、簡便易行。

[1] 李素云, 李崢, 李敬來, 等. 槲皮素及其糖苷衍生物的研究進(jìn)展[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報, 2011(6): 540-543.

[2] 阿布拉江·克依木. 黃酮苷類天然產(chǎn)物的質(zhì)譜分析方法研究[D]. 北京: 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué), 2006.

[3] 王艷芳, 王新華, 朱宇同. 槲皮素藥理作用研究進(jìn)展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2003(2): 171-173.

[4] JAN A T, KAMLI M R, MURTAZA I, et al. Dietary flavonoid quercetin and associated health benefi tsan overview[J]. Food Reviews International, 2010, 26(3): 302-317.

[5] 周進(jìn), 方麗, 姚文秀, 等. 細(xì)胞培養(yǎng)氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記-質(zhì)譜技術(shù)測定槲皮素對人肝癌細(xì)胞熱休克蛋白表達(dá)的影響[J]. 中華腫瘤雜志, 2011, 33(10): 737-741.

[6] KOBORI M, MASUMOTO S, AKIMOTO Y, et al. Dietary quercetin alleviates diabetic symptoms and reduces streptozotocin-induced disturbance of hepatic gene expression in mice[J]. Molecular Nutrition and Food Research, 2009, 53(7): 859-868.

[7] STEWART L K, SOILEAU J L, RIBNICKY D, et al. Quercetintransiently increases energy expenditure but persistently decreases circulating markers of infl ammation in C57BL/6J mice fed a high-fat diet[J]. Metabolism, 2008, 57(7): 39-46.

[8] OVERMAN A, CHUANG C C, MCINTOSH M. Quercetin attenuates inflammation in human macrophages and adipocytes exposed to macrophage-conditioned media[J]. International Journal of Obesity, 2011, 35(9): 1165-1172.

[9] YANG Lei, LI Xiaofan, GAO Lei, et al. Suppressive effects of quercetin-3-O-(6’-feruloyl)-beta-D-galactopyranoside on adipogenesis in 3T3-L1 preadipocytes through down-regulation of PPARgamma and CEBPalpha expression[J]. Phytotherapy Research, 2012, 26(3): 438-444.

[10] AHN J, LEE H, KIM S, et al. The anti-obesity effect of quercetin is mediated by the AMPK and MAPK signaling pathways[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2008, 373(4): 545-549.

[11] KOBORI M, MASUMOTO S, AKIMOTO Y, et al. Chronic dietary intake of quercetin alleviates hepatic fat accumulation associated with consumption of a Western-style diet in C57BL6J mice[J]. Molecular Nutrition and Food Research, 2011, 55(4): 530-540.

[12] KIM J H, KANG M J, CHOI H N, et al. Quercetin attenuates fasting and postprandial hyperglycemia in animal models of diabetes mellitus[J]. Nutrition Research and Practice, 2011, 5(2): 107-111.

[13] JEONG S M, KANG M J, CHOI H N, et al. Quercetin ameliorates hyperglycemia and dyslipidemia and improves antioxidant status in type 2 diabetic dbdb mice[J]. Nutrition Research and Practice, 2012, 6(3): 201-207.

[14] 許春蓮, 胡曉鵑, 邱奇琦, 等. 小鼠血漿中槲皮素脂溶性及水溶性代謝產(chǎn)物的分離與測定[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(6): 132-136.

[15] 陳燕. 蕎麥蜂花粉中槲皮素、異鼠李素含量的測定[J]. 食品科技, 2009, 34(9): 267-269.

[16] 曾誠, 宓穗卿, 羅頌平, 等. 菟絲子灌胃大鼠槲皮素含量測定及藥代動力學(xué)研究[J]. 中醫(yī)藥學(xué)刊, 2004(6): 1148-1150.

[17] 曾誠, 羅頌平, 宓穗卿, 等. 菟絲子活性成分槲皮素含量測定中HPLC方法的建立[J]. 中國中醫(yī)藥信息雜志, 2004(8): 701-703.

[18] 甘盛, 施曉光, 韓婷, 等. 高效液相色譜法同時測定葡萄籽中蘆丁、槲皮素與異槲皮素的含量[J]. 中南藥學(xué), 2011(12): 894-897.

[19] 張麗華, 張陽德, 張洋, 等. 高效液相色譜法測定大鼠血漿中槲皮素的含量[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2011(5): 549-551.

[20] 王增仙. 高效液相色譜-質(zhì)譜法測定血漿中槲皮素及其主要代謝產(chǎn)物[J]. 中成藥, 2012(4): 750-753.

[21] ERLUND I, MARNIEMI J, HAKALA P, et al. Consumption of black currants, lingonberries and bilberries increases serum quercetin concentrations[J]. European Journal of Clinical Nutrition, 2003, 57(1): 37-42.

[22] 洪葉嵐, 馬驥, 肖婭萍, 等. 反相高效液相色譜法對秦嶺21 種蕨類植物中槲皮素與山柰酚含量的測定[J]. 分析測試學(xué)報, 2010(3): 294-297.

[23] 董文庚, 鄧曉麗, 苗鳳智, 等. HPLC法測定銀杏葉中黃酮的含量[J].理化檢驗: 化學(xué)分冊, 2005(8): 563-565.

[24] 陳峰, 符乃光, 任守忠, 等. 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定大鼠血漿中的槲皮素代謝物[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2008(3): 225-227.

[25] GRAF B A, AMEHO C, DOLNIKOWSKI G G, et al. Rat gastrointestinal tissues metabolize quercetin[J]. The Journal of Nutrition, 2006, 136(1): 39-44.

Determination of Quercetin in Serum of High Fat Diet-Fed Mice by HPLC-UV

BIAN Huixi1, CAI Jing1, WU Zeyu2, ZHANG Xian1, LIU Jian1
(1. School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; 2. Engineering Research Center of Bio-process, Ministry of Education, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

The quercetin content of serum from diet-induced obese mice was determined by high-performance liquid chromatography fi tted with an ultraviolet detector (HPLC-UV) and an Agilent Eclipse XDB-C18column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm). The mobile phase was a mixture of acetonitrile-0.2% formic acid (40:60, V/V) with a fl ow rate of 0.5 mL/min, and the detection wavelength was 360 nm. There was a good linear relationship for quercetin in the range of 2.5-40 μg/mL (r = 0.999 1). The average recovery rate for quercetin was 96.0% with relative standard deviation (RSD) of 10.98% (n = 5). This method could be used to determine quercetin in serum with good recovery rate and repeatability. It was a simple, rapid and accurate analytical method.

high performance liquid chromatography; ultraviolet detector; high fat diet; serum; quercetin

O657

A

1002-6630（2015）20-0086-04

10.7506/spkx1002-6630-201520015

2015-01-13

國家自然科學(xué)基金面上項目（31171315）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項（2013HGQC0040）

邊會喜（1983—），男，博士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：bhx1983@163.com