復(fù)方中草藥提取物抑菌活性成分研究

劉 敏 周 茜 郝紅偉 王唯霖 劉新愚 趙 文（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001）

從中草藥篩選抗菌藥物用于防治疾病已經(jīng)成為解決抗生素濫用問題的有效途徑之一。近年來，有很多研究［1－7］從不同的角度，對(duì)中草藥的抑菌作用進(jìn)行了多方面的探討。結(jié)果顯示，很多中藥能阻止病原微生物的生長，屬天然的抑菌材料。但是中藥是典型的復(fù)雜物質(zhì)體系，如何從中篩選出藥效物質(zhì)，又如何將它們進(jìn)行有效分離，其被分離產(chǎn)物能否代表中藥的功用，這些實(shí)質(zhì)上就是中藥提取分離技術(shù)領(lǐng)域所面臨的科學(xué)問題。

目前對(duì)中藥復(fù)方有效部位研究常采用現(xiàn)代分離提取方法，將其分離成為各個(gè)有效部分，如揮發(fā)油、生物堿類、黃酮類、香豆素類、多糖類等。每個(gè)有效部分又可以分為化學(xué)性質(zhì)相近的化合物群，這樣一個(gè)復(fù)雜的中藥復(fù)方就可以分為幾種或十幾種有效部位，再和藥效學(xué)相結(jié)合就可以闡明中藥復(fù)方協(xié)同配伍的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。因此研究人員提出了包括現(xiàn)代分離方法提取有效成分，指紋圖譜定性，指標(biāo)成分定量，有效成分和藥效學(xué)研究相結(jié)合的整體中藥復(fù)方研究思路，如對(duì)銀翹散［8］、四逆散［9］、清腦宣竅方［10］等中藥材的研究。本課題組［11］前期研究表明，以烏梅、馬齒莧、大青葉為主要成分的復(fù)方中草藥具有一定的抑菌作用。目前，中國關(guān)于烏梅、馬齒莧、大青葉的抑菌作用及成分的報(bào)道較多。劉夢(mèng)茵等［12］通過薄層層析—生物自顯影技術(shù)初步確定了烏梅醇提物中起主要抑菌作用的是有機(jī)酸。馬齒莧中含有有機(jī)酸類、黃酮類、萜類、香豆素類、生物堿類、揮發(fā)油和多糖［13］，其中馬齒莧多糖具有一定的抑菌、消炎作用［14］。大青葉對(duì)脆弱類無芽孢厭氧桿菌也有較強(qiáng)的抑制作用。其抗菌有效成分為色胺酮和一些吲哚類衍生物［15］。本研究擬在前期研究［11，16］的基礎(chǔ)上，采用有機(jī)溶劑萃取法確定該復(fù)方中草藥的抑菌活性部位。課題研究初期，考慮到中草藥成分的復(fù)雜性，不可能把每一種成分都提取出來進(jìn)行成分的鑒定，參照組分中藥研究的思路，采用系統(tǒng)分離的方法將中草藥水提液精制后分為低、中、高三類不同的極性組分，而后通過體外抑菌試驗(yàn)篩選出了抑菌作用最強(qiáng)的組分。旨為進(jìn)一步研究該復(fù)方的藥效成分提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

烏梅、馬齒莧、大青葉、野菊花、魚腥草、柴胡、黃柏、香薷、生地：購于保定市某藥房。

1.2 試劑

95%乙醇：分析純，天津市紅巖化學(xué)試劑廠；

正己烷、二甲基亞砜（DMSO）：分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠；

乙酸乙酯：分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；

正丁醇：分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；

氯化鈉：分析純，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；

營養(yǎng)瓊脂：分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；

牛肉膏、蛋白胨、酵母浸出物：分析純，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠。

1.3 菌種

大腸桿菌O157：H7、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌：由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供，本實(shí)驗(yàn)室斜面保藏。

1.4 儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE－52A型，上海亞榮生化儀器廠；

冰箱：BCD－205F/T型，海爾集團(tuán)；

電子天平：SB1.T－014型，上海奧豪斯國際貿(mào)易有限公司；

電熱恒溫干燥箱：202－1－BS型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；

生化培養(yǎng)箱：SPX－150S－Ⅱ型，上海新黃醫(yī)療器械制造有限公司；

潔凈工作臺(tái)：SW－CJ－1FD型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

手提式壓力蒸汽滅菌器：YXQ.SG41.280型，上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；

移液槍：DS14364型，容量100～1 000μL，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司；

高速多功能粉碎機(jī)：BL－100型，浙江省永康市松青五金工具廠；

超聲波清洗機(jī)：QTSX/6150型，奇拓儀器有限公司；

水浴鍋：HH－2型，江蘇省常州國華電器有限公司；

酸度計(jì)：PHS－3C型，上?？祪x儀器有限公司。

1.5 方法

1.5.1 復(fù)方中草藥提取物的制備 將烏梅、馬齒莧、大青葉、野菊花、魚腥草、柴胡、黃柏、香薷、生地按文獻(xiàn)［11］的方法制備中草藥水煎液，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 醇沉條件的優(yōu)化 醇沉技術(shù)可以有效去除水提液中的大分子及多糖類物質(zhì)，達(dá)到精制的目的。在醇沉條件優(yōu)化中，根據(jù)參考文獻(xiàn)［17～19］以及預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，得到濃縮液的密度為0.5g/mL和醇沉24h效果最好，所以只考察了含醇量的影響。選取乙醇終體積分?jǐn)?shù)為60%，70%，75%，80%，85%，90%進(jìn)行醇沉提取。

按前期研究［16］的處方量稱取烏梅等100g，按水提工藝提取，濃縮至質(zhì)量濃度為0.5g/mL，藥液放冷后，用90%的乙醇邊攪拌邊加入至規(guī)定體積分?jǐn)?shù)，4℃密閉冷藏24h，傾取上清液濾過，沉淀用規(guī)定濃度的乙醇洗滌，合并濾液，濾液回收乙醇至無醇味，回收液置已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105℃干燥3h，移至干燥器中冷卻30min，迅速精密稱定重量，以浸出物與原生藥量之比作為干膏率。根據(jù)干膏率確定最佳提取工藝。

1.5.3 復(fù)方中草藥的抑菌活性部位確定

（1）樣品溶劑的選擇：考慮到有機(jī)溶劑會(huì)對(duì)微生物的生長有一定的影響，影響后期抑菌試驗(yàn)的進(jìn)行［20］，需要選取一種既能溶解不同極性的物質(zhì)，又不會(huì)對(duì)微生物的生長產(chǎn)生影響的溶劑。

試驗(yàn)選用蒸餾水、正己烷、乙酸乙酯、正丁醇、20%DMSO，40%DMSO，60%DMSO，80%DMSO 及 純 DMSO進(jìn)行提取物溶解能力的試驗(yàn)。同時(shí)用這幾種溶劑進(jìn)行大腸桿菌O157：H7、金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌抑菌試驗(yàn)。

（2）提取方法：采用不同極性的溶劑對(duì)提取物進(jìn)行萃取，富集抑菌有效組分，依次用正己烷、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行，每種溶劑等體積萃取3次。而后減壓旋蒸回收溶劑，真空干燥至干，得4種極性的浸膏。

（3）抑菌試驗(yàn)：在明確了不同溶劑抑菌作用的前提下，選擇各部浸膏適合的溶劑，均配制成2.0g/mL溶液備用。

將已計(jì)數(shù)的大腸桿菌O157：H7、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌菌液稀釋到106CFU/mL，采用牛津杯法對(duì)不同極性復(fù)方中草藥提取物進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察牛津杯周圍是否有透明圈，若有，測(cè)量其大??；若沒有，表明該極性部分對(duì)菌無抑制作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 醇沉條件的優(yōu)化

由表1可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，干膏率趨于平穩(wěn)，乙醇濃度達(dá)到85%以上時(shí)，干膏率逐漸降低。因此，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合生產(chǎn)成本，選擇70%做為最佳醇沉濃度。由此得到醇沉最佳工藝條件為：水煎液密度0.5g/mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，4℃下靜置24h。

表1 醇沉條件選擇Table 1 Optimization of ethanol－precipitation（n＝3）%

2.2 復(fù)方中草藥的抑菌活性部位確定

2.2.1 樣品溶劑的選擇 由表2可知，正己烷及乙酸乙酯均無抑菌作用，可以作為正己烷相及乙酸乙酯相的溶劑，正丁醇有極強(qiáng)的抑菌作用，不可作為正丁醇相的溶劑。溶解能力試驗(yàn)中正己烷能夠完全溶解正己烷相浸膏，而乙酸乙酯不能完全溶解乙酸乙酯相浸膏。因此，選用正己烷為正己烷相浸膏的溶劑。

表2 溶劑抑菌效果Table 2 The antibacterial effect of the solvent（n＝3）mm

表2 溶劑抑菌效果Table 2 The antibacterial effect of the solvent（n＝3）mm

“—”表示無細(xì)菌生長，被完全抑制。

溶劑 大腸桿菌O157：H7腸炎沙門氏菌 金黃色葡萄球菌正己烷6.00 6.00 6.00乙酸乙酯 6.00 6.00 6.00正丁醇 — — —

由表3可知，20%的DMSO對(duì)微生物的生長無影響，DMSO的濃度越大，抑菌作用越大。而80%的DMSO才能全部溶解乙酸乙酯相浸膏。

表3 DMSO對(duì)兩種致病菌的抑菌圈直徑Table 3 Antibacterial diameter of DMSO（n＝3）mm

表3 DMSO對(duì)兩種致病菌的抑菌圈直徑Table 3 Antibacterial diameter of DMSO（n＝3）mm

“—”表示無抑菌效果。

DMSO濃度/% 大腸桿菌O157：H7金黃色葡萄球菌20——40 8.13±0.21 5.97±0.25 60 11.06±0.32 12.10±0.36 80 16.13±0.30 15.70±0.66 100 19.87±0.51 18.86±0.32

綜合所述，本試驗(yàn)中樣品溶劑選擇方式為：正己烷溶解正己烷相浸膏，80%的DMSO溶解乙酸乙酯相浸膏，蒸餾水溶解正丁醇相、水相浸膏。

2.2.2 抑菌試驗(yàn)結(jié)果 由表4可知，復(fù)方中草藥水煎液對(duì)3種菌均有一定的抑制作用。對(duì)腸炎沙門氏菌的抑制作用最強(qiáng)，金黃色葡萄球菌次之，對(duì)大腸桿菌O157：H7的抑制作用最弱。醇沉上清液對(duì)3種菌都有明顯的抑制作用，并且抑菌強(qiáng)度較水煎液有明顯的增強(qiáng)。醇沉后的沉淀物對(duì)3種菌基本無抑制作用。由此可知，水提醇沉起到了很好的去除中藥水煎液中雜質(zhì)的作用。

由表5可知，正己烷相無抑菌作用，其余各相對(duì)3種致病菌均有一定的抑制作用，其中乙酸乙酯相對(duì)3種菌的實(shí)際抑菌圈直徑均需扣除空白80%DMSO的抑菌圈直徑。乙酸乙酯相對(duì)3種菌的抑制作用強(qiáng)弱順序?yàn)椋耗c炎沙門氏菌＞大腸桿菌O157：H7＞金黃色葡萄球菌。正丁醇相有較強(qiáng)的抑菌作用，對(duì)3種菌的抑制作用強(qiáng)弱相近。水相也有較好的抑菌作用，對(duì)大腸桿菌O157：H7及腸炎沙門氏菌的抑制作用較強(qiáng)，金黃色葡萄球菌抑制作用次之。各相抑菌作用強(qiáng)弱順序?yàn)椋赫〈枷啵舅啵疽宜嵋阴ハ啵菊和橄?。由此可見，抑菌活性物質(zhì)主要是一些高極性的物質(zhì)，其余物質(zhì)發(fā)揮協(xié)同作用。

表4 樣品的抑菌圈直徑Table 4 Antibacterial diameter of the samples（n＝3）mm

表5 樣品的抑菌圈直徑Table 5 Antibacterial diameter of the samples（n＝3）cm

3 結(jié)論

本研究確定了復(fù)方中草藥提取物中的抑菌活性成分探究的前處理方式為水提醇沉。醇沉最佳工藝條件為：水煎液密度0.5g/mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，4℃靜置24h。采用有機(jī)溶劑萃取法將復(fù)方中草藥提取物中的成分分為4個(gè)不同的極性部分。體外抑菌試驗(yàn)中，溶劑的選擇是一個(gè)難點(diǎn)。本研究選用的溶劑DMSO本身就對(duì)微生物的生長有很大的影響，試驗(yàn)的目的是確定該極性部分是否有抑菌作用，因此對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有一定的干擾。通過試驗(yàn)，正己烷提取物與空白相比抑菌圈直徑相近，因此認(rèn)為其無抑菌作用，而乙酸乙酯提取物抑菌圈直徑比空白的大，因此判定這部分物質(zhì)有一定的抑菌作用。各相的抑菌作用強(qiáng)弱順序?yàn)椋赫〈枷啵舅啵疽宜嵋阴ハ啵菊和橄?。表明抑菌活性物質(zhì)主要是一些高極性的物質(zhì)，其余物質(zhì)發(fā)揮協(xié)同作用。這與劉夢(mèng)茵等［12－15］關(guān)于烏梅、馬齒莧、大青葉中抑菌物質(zhì)的研究結(jié)果相一致。在今后的研究中需對(duì)強(qiáng)極性部分的主要成分進(jìn)行闡述，進(jìn)一步揭示該復(fù)方的抑菌活性成分。

1 劉富來，陳志華，馮翠蘭，等.中草藥對(duì)禽大腸桿菌的體外抑菌試驗(yàn)［J］.甘肅畜牧獸醫(yī)，2003，33（2）：12～14.

2 張海暉，裘愛泳，劉軍海，等.中藥大黃提取物對(duì)幾種畜禽致病菌的抑菌作用研究［J］.飼料工業(yè)，2004，25（11）：24～26.

3 李樹明，張鳳鳴，雷燕，等.50味中藥對(duì)8種畜禽病原菌抑菌對(duì)比研究［J］.中獸醫(yī)學(xué)雜志，2000（4）：5～8.

4 胡建軍，劉利林，黃金奎，等.植物提取物體外抑菌試驗(yàn)的研究［J］.塔里木農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，16（2）：5～8.

5 毛瓊，羅宗銘，宋曉崗.幾種中草藥提取物抑菌作用研究［J］.食品與機(jī)械，1999（1）：38～39.

6 Akubu M Bello，Odama L E，Nandita B De.Studies on the antibacterial activity of the extract of stachysarpheta angustifolia［J］.Acta Universitatis Medicinalis Nan Jing，2003，23（4）：424～424.

7 Zakaria El Astal.The inhibitory action of aqueous garlic extract on the growth of certain pathogenic bacteria［J］.European Food Research and Technology，2004，218（5）：460～464.

8 李軍，石任兵，劉斌.反相高效液相色譜法測(cè)定四逆散抗抑郁有效部位中新橙皮苷的含量［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27（1）：54～56.

9 陳玉平，石任兵，劉斌.RP—HPLC法測(cè)定清腦宣竅方有效部位中藏紅花酸含量［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27（3）：63～65.

10 李錚，石任兵，劉斌.HPLC法測(cè)定參芍心欣方有效部位中芍藥苷含量［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，26（2）：47～49.

11 王思思.選擇性抑菌中草藥篩選及組方研究［D］.保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

12 劉夢(mèng)茵，劉芳，周濤，等.烏梅乙醇提取物抑菌作用及其抑菌成分分析［J］.食品科學(xué)，2011，32（17）：190～193.

13 解思友，逢美芳，孫艷，等.馬齒莧的化學(xué)成分與藥理作用最新研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2011，26（3）：212～215.

14 楊哲，肖根生，楊永生.馬齒莧多糖的提取功效及其在畜禽飼料生產(chǎn)中的應(yīng)用［J］.湖南飼料，2012（4）：19～20.

15 侯家玉，方泰惠.中藥藥理學(xué)［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2007：54～55.

16 楊建喬.復(fù)方中草藥提取物替代飼用抗生素的應(yīng)用研究［D］.保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

17 張黎明，朱麗，李雪，等.玉屏風(fēng)總多糖水提醇沉工藝條件優(yōu)化［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（1）：26.

18 閻雪梅，李鳳麗，宋潔瑾.暑熱寧合劑水提醇沉工藝研究［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2012，29（8）：703～704.

19 肖瓊，沈平婊.中藥醇沉工藝的關(guān)鍵影響因素［J］.中成藥，2005，27（2）：143～144.

20 高微微，李展，林文衛(wèi)，等.中草藥提取物對(duì)沙門氏菌的抑菌試驗(yàn)［J］.中獸醫(yī)醫(yī)學(xué)雜志，1998（5）：11～13.