利用電子自旋共振技術(shù)研究黃海海燕體壁多糖的體外抗氧化活性

劉 山 李 楠 傅 卉 許 喆 常思佳 秦 磊 董秀萍 啟 航（.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 6034；2.國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 6034）

黃海海燕（Asterina pectinifera）俗稱海星，屬于棘皮動物門，黃海海燕綱，是海洋中常見的無脊椎動物之一［1］。在中國沿海，海星蘊藏量比較豐富，其種類多達100余種，廣泛分布在東海、南海、黃渤海、臺灣近海等各大海域［2］。海星是兇猛的肉食動物，以鮑魚、扇貝、海膽等海珍品為食，對沿海養(yǎng)殖造成極大危害。但同時海星作為海產(chǎn)廢棄物加工再利用的相關(guān)研究越來越引起人們的廣泛關(guān)注。

海星含有的活性物質(zhì)主要為皂苷、脂類、甾醇類化合物、多糖和膠原蛋白等。海星體壁的酸性粘多糖與哺乳動物結(jié)締組織中的酸性粘多糖相比，除了含有氨基己糖、己糖醛酸和硫酸基外，還含有巖藻糖［3］。相關(guān)研究表明，海星體壁酸性粘多 糖 具 有 增 強 免 疫 力［4］、抗 凝 血［5］、抗 血 栓［6］、降 血脂［7］、降血糖等作用。

多糖具有較好的抗氧化活性。Zhu Bei－wei等［8］從鮑魚性腺中提取硫酸多糖，試驗研究表明鮑魚性腺硫酸多糖具有顯著的清除羥基自由基能力。Huang Gang－liang等［9］提取黃瓜多糖，試驗研究表明黃瓜多糖對超氧陰離子具有很強的清除作用。Yang Meng－tao等［10］制備納米硒牡蠣多糖，試驗研究表明納米硒牡蠣多糖是一種有效的羥基自由基和DPPH自由基清除劑。

電子自旋共振技術(shù)（electron spin resonance，ESR）又稱電子順磁共振，是在磁場中測量未成對電子［11］，可以探測和識別具有未成對電子的分子，是檢測自由基最直接有效的方法［12］，其檢測靈敏度高，樣品消耗量小，效率高，ESR是近年來在食品領(lǐng)域新興的一種檢測技術(shù)［13］，在黃海海燕酸性粘多糖抗氧化研究方面的應(yīng)用未見報道。本研究擬以新鮮黃海海燕體壁為原料分別制備黃海海燕粗多糖和精多糖，并應(yīng)用ESR分別檢測兩種多糖對羥基自由基、DPPH和超氧陰離子的體外清除作用，以期拓展ESR在水產(chǎn)品加工貯藏及生理活性物質(zhì)領(lǐng)域的應(yīng)用，旨在為開發(fā)具有抗氧化功能的水產(chǎn)食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

黃海海燕：大連太平洋海珍品有限公司；

DPPH、嘌呤氧化酶：美國Sigma－Aldrich公司；

次黃嘌呤、EDTA－2Na：生工生物工程（上海）股份有限公司；

二甲基吡咯啉氮氧化物（DMPO）、二乙胺三胺五乙酸（DETAPAC）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；

其余試劑：分析純，市售。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平：AL204型，賽多利斯科學(xué)儀器有限責(zé)任公司；

磁力攪拌機：90－3型，上海振榮科技儀器有限公司；

臺式低速離心機：L550型，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；

真空冷凍干燥機：ZKBTES－55型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ－250DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

紫外可見分光光度計：UV－5200型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

漩渦混合器：XW－80型，上海精科實業(yè)有限公司；

熒光酶標(biāo)儀：M200型，瑞士Tecan公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH－4型，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；

電子順磁共振波譜儀：A200型，德國Bruker Opertics公司。

1.2 方法

1.2.1 黃海海燕體壁粗多糖及精多糖的制備 將黃海海燕體壁與內(nèi)臟分離，凍干體壁，粉碎，過200目篩得到體壁干粉。按1∶4（m∶V）的比例加入0.1mol/L的 NaBH4與NaOH的混合溶液，于60℃攪拌過夜。冷卻攪拌過夜后的液體，加三氯乙酸將pH值調(diào)至4.0，于4 000r/min離心15min；離心后取上清液，調(diào)節(jié)其pH值為7.0，加入1mg的中性蛋白酶，于50℃攪拌過夜；將攪拌過夜后的溶液冷卻，于4 000r/min離心15min。取上清液加入其體積1/8濃度為5%的雙氧水，于55℃條件下保溫脫色，直至溶液變?yōu)榈S色；加入4倍體積的95%乙醇，于4℃的層析柜中醇沉，4 000r/min離心15min。取沉淀溶于適量水中，60℃水浴加熱，使其充分溶解，凍干，得到黃海海燕體壁粗多糖。

將黃海海燕體壁粗多糖提取液的pH值調(diào)節(jié)至7.0，加入0.5mg的中性蛋白酶，于50℃攪拌過夜。用三氯乙酸調(diào)節(jié)使pH值為4.0，于4 000r/min離心15min。取上清液，加入4倍體積95%的乙醇，于4℃的層析柜中進行醇沉，10 000r/min離心15min。離心后的沉淀依次用乙醇、丙酮進行洗滌。將洗滌后的固體冷凍干燥，即得到黃海海燕體壁精多糖。

1.2.2 多糖含量的測定 采用苯酚—硫酸法［14］，以干基計算。

1.2.3 清除羥基自由基活性的測定 參照文獻［13］。

1.2.4 清除DPPH自由基活性的測定 參照文獻［13］。

1.2.5 清除超氧陰離子活性的測定 參照文獻［13］。

1.2.6 統(tǒng)計分析方法 用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，使用單向方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗多糖和精多糖的含量

黃海海燕體壁粗多糖經(jīng)過2次酶解、除蛋白、乙醇醇沉等一系列方法純化后，得到黃海海燕精多糖。苯酚硫酸法測得黃海海燕體壁粗多糖和精多糖的含量分別為5.21%，7.50%。

2.2 對羥基自由基的清除作用

由圖1可知，ESR檢測到典型的峰高為1∶2∶2∶1的加合物特征峰。羥基自由基的ESR信號強度（峰高）隨著濃度的增大而減小，表明黃海海燕體壁粗多糖和精多糖對羥基自由基的清除效果顯著增強（P＜0.05）。在20mg/mL濃度時，精多糖對羥基自由基的清除率為40.20%，遠高于粗多糖的清除率（7.98%）。黃海海燕體壁粗多糖和精多糖對羥基自由基清除能力的IC50值分別為59.56，44.96mg/mL。按糖含量計，黃海海燕體壁粗多糖和精多糖清除羥基自由基的IC50分別為3.10，3.37mg/mL，略強于Jiang Chang－xing等［15］報道的青蛤多糖羥基自由的清除活性（IC50＝4.00mg/mL）。

圖1 黃海海燕體壁粗多糖和精多糖對羥基自由基的清除作用Figure 1 The scavenging effect of raw and refined polysaccharide of Asterina pectinifera body walls on hydroxyl radical

2.3 對DPPH的清除作用

由圖2可知，黃海海燕體壁粗多糖和精多糖都具有一定清除DPPH的作用，隨著濃度的升高，峰高逐漸降低，清除作用增大（P＜0.05）。對于相同濃度的黃海海燕體壁粗多糖和精多糖，精多糖對DPPH的清除能力大于粗多糖，在20mg/mL濃度時，清除率分別為56.98%，39.88%。黃海海燕體壁粗多糖和精多糖對DPPH清除能力的IC50值分別為27.29，13.97mg/mL。按糖含量計，黃海海燕體壁粗多糖和精多糖清除 DPPH 自由基的IC50為1.42，1.05mg/mL。其清除DPPH 自由基的活性優(yōu)于文獻［16］（IC50＝2.00mg/mL）和文獻［17］（IC50＝3.11mg/mL）報道的海參多糖的 DPPH 清除活性。

圖2 黃海海燕體壁粗多糖和精多糖對DPPH的清除作用Figure 2 The scavenging effect of raw and refined polysaccharide of Asterina pectinifera body walls on DPPH

2.4 對超氧陰離子的清除作用

由圖3可知，隨著濃度的升高，ESR信號強度遞減，說明清除超氧陰離子的能力逐漸增強，各濃度間差異顯著（P＜0.05）。在20mg/mL濃度時，黃海海燕體壁粗多糖和精多糖對超氧陰離子清除率分別為37.72%，44.27%。黃海海燕體壁粗多糖和精多糖對超氧陰離子清除能力的IC50值分別為32.36，30.51mg/mL。按純糖含量計，黃海海燕體壁粗多糖和精多糖清除超氧陰離子的IC50為1.68，2.29mg/mL，其對超氧陰離子的清除活性強于Liu Xin等［17］報道的海參多糖清除超氧陰離子的活性（IC50＝4.05mg/mL）。

圖3 黃海海燕體壁粗多糖和精多糖對超氧陰離子的清除作用Figure 3 The scavenging effect of raw and refined polysaccharide of Asterina pectinifera body walls on superoxide anion

3 結(jié)論

海燕體壁精多糖較粗多糖有更好的清除活性，說明黃海海燕體壁多糖是很好的抗氧化物質(zhì)。并且ESR是研究體外抗氧化活性的一種重要的分析手段。下一步將對黃海海燕體壁多糖的體內(nèi)抗氧化活性進行研究。

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