納米磁性四氧化三鐵固定脂肪氧合酶的研究

丁文武 曹汝毅 孫銘珍 夏云空（.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 6009；.山東師范大學(xué)歷山學(xué)院，山東 濟(jì)南 5004；.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 6009）

脂肪氧合酶是一類較為常見(jiàn)的酶，應(yīng)用前景廣闊，可用于染料、涂料和洗滌劑等工業(yè)化生產(chǎn)［1－3］。然而，由于脂肪氧合酶在動(dòng)植物中含量低、分離純化難導(dǎo)致其價(jià)格高，穩(wěn)定性也較差，難以在工業(yè)上廣泛應(yīng)用。將酶固定化可以加強(qiáng)酶的穩(wěn)定性，并可以重復(fù)利用從而降低生產(chǎn)成本。因此，酶固定化技術(shù)一直是酶應(yīng)用研究領(lǐng)域中一項(xiàng)引人注目且非常重要的課題［4］。

用于固定化酶的載體和方法有很多，其中采用磁性微球固定化酶，不僅會(huì)大大提高酶的穩(wěn)定性［5］，而且利用載體具有磁性的特點(diǎn)可以組裝成磁性流化床或固定床反應(yīng)器，有利于固定化酶的進(jìn)一步應(yīng)用［6］，因此磁性微球固定化酶的研究成為許多研究者［7－9］青睞的課題。目前，用于固定化酶的主要載體之一是納米Fe3O4。納米Fe3O4的制備方法有多種，如水熱法、溶膠—凝膠法和共沉淀法等［10］。此外，由于納米Fe3O4離子具有非常大的比表面積以及比表面能，從而導(dǎo)致其在制備以及應(yīng)用過(guò)程中極易發(fā)生團(tuán)聚，進(jìn)而嚴(yán)重影響其使用，因此必須對(duì)其進(jìn)行表面改性以消除影響［11］。將酶固定在磁性微球上的方法主要有吸附法和共價(jià)法等［12］，盡管酶的固定化方法很多，但到目前為止，很難找到一種適用于各種酶的固定化方法，因此，研究并找到適宜的固定化方法仍是固定化酶研究的熱點(diǎn)課題［13］。

本研究擬通過(guò)水熱法制備納米磁性Fe3O4，并用SiO2和KH550對(duì)粒子進(jìn)行表面修飾得到納米磁性載體，然后用交聯(lián)法固定脂肪氧合酶，研究影響酶活的因素，討論固定方法的適宜性，以便為該酶找到合適的固定化方法，從而為其進(jìn)一步的應(yīng)用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 材料與試劑

硝酸鉀、氫氧化鉀、七水合硫酸亞鐵、無(wú)水乙醇、正硅酸四乙酯、氨水、亞油酸等：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

石油醚：化學(xué)純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；

戊二醛、過(guò)氧化氫：分析純，成都市科龍化工試劑公司；

Tween－20（CP）：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

KH550：化學(xué)純，浙江新安有機(jī)硅試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

pH計(jì)：PHS－25CW型，上海般特儀器制造有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：DK－S28型，上海森信儀器有限公司；

雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：TU－1901型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 納米磁性載體的制備 分別向圓底燒瓶中加入濃度為0.6moL/L、體積為25mL的 Na2S2O3·5H2O溶液和濃度為4.0moL/L、體積為25mL的NaOH溶液，攪拌混合均勻，再向燒瓶中逐滴加入濃度為4.0moL/L、體積為50mL的FeSO4·7H2O溶液，持續(xù)攪拌1h后，將體系轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜，加熱至160℃使其持續(xù)反應(yīng)16h，取出反應(yīng)體系，用磁鐵將體系中黑色物質(zhì)分離出來(lái)并水洗3次，得到黑色物質(zhì)即為納米磁性Fe3O4；室溫下，將100mL乙醇、10mL水和2.5mL正硅酸四乙酯分別加入燒瓶中，攪拌5min后，向其中加入2.0mL的濃氨水以及制備的納米Fe3O4，繼續(xù)攪拌10h后，磁鐵分離獲得SiO2包裹的納米Fe3O4；將54g乙醇、3g水及2.28g KH550分別加入燒瓶中，水解10min后，加入上述步驟制備的SiO2包裹的納米Fe3O4，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌2h后，磁鐵分離即獲得以SiO2和KH550修飾的納米磁性載體，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 脂肪氧合酶的固定化 將大豆粉碎，然后用40目的篩子篩分去皮，再按照固液比為1∶5（m∶V）的比例用石油醚對(duì)大豆浸提5次；取50g脫脂大豆粉于圓底燒瓶中并加水350mL，室溫下攪拌1h后，攪拌液于4 000r/min離心20min，收集上清液即為粗酶液，保存?zhèn)溆茫蝗?.5g納米磁性載體和50mL粗酶液加入到燒瓶中，超聲使其分散后，加入1.0g戊二醛（占體系總量2%），常溫?cái)嚢?h后，以強(qiáng)力磁鐵分離出反應(yīng)液中的固體物質(zhì)，并用水洗滌3次后，即得納米固定化酶微粒，密封于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 底物溶液的配制及酶活的測(cè)定 參照文獻(xiàn)［14］。

1.2.4 酶活影響因素的測(cè)定

（1）pH值的影響：將粗酶液（或固定化酶0.05g）加入到pH分別為6，7，8，9，10的反應(yīng)體系中，20℃反應(yīng)后，進(jìn)行酶活測(cè)定。

（2）溫度的影響：將粗酶液（或固定化酶0.05g）置于溫度分別為20，25，30，35，40，45℃的水浴中進(jìn)行反應(yīng)后，測(cè)定酶活。

（3）H2O2濃度的影響：將粗酶液（或固定化酶0.05g）加入到 H2O2濃度分別為0，3，6，9，12，15，18g/L的反應(yīng)體系中，恒溫（游離酶30℃，固定化酶25℃）反應(yīng)后進(jìn)行酶活測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米Fe3O4形貌分析

對(duì)固定化酶而言，載體結(jié)構(gòu)和組成直接影響著固定化酶的活性及其催化效率。將制備好的Fe3O4粒子在無(wú)水乙醇中超聲分散一定時(shí)間后，用電子顯微鏡進(jìn)行觀察。由圖1可知，載體為亮黑色短棒狀粒子，平均長(zhǎng)度約為600nm，平均粒徑約為40nm，由于制備的粒子粒徑屬于納米范圍，從而具備了很高的比表面積，因此使得粒子具有非常高的表面自由能［15］，而粒子之間的團(tuán)聚可以有效降低表面自由能，使體系逐漸趨于穩(wěn)定，因此從圖1中可以所看到粒子有一定的聚集。

圖1 Fe3O4納米粒子電鏡圖Figure 1 TEM image of naked Fe3O4nanoparticles

2.2 Fe3O4及固定化酶的XRD分析

Fe3O4及固定化酶的XRD分析見(jiàn)圖2。Fe3O4會(huì)在2θ為30.1°，35.5°，43.1°，53.3°，57.4°，62.3°下出現(xiàn)了6個(gè)特征峰，而由圖2可知所檢測(cè)的固定化酶出現(xiàn)了與Fe3O4相同的特征峰，說(shuō)明對(duì)Fe3O4的表面修飾和酶的固定化，并沒(méi)有改變合成的磁性納米Fe3O4的內(nèi)部晶體結(jié)構(gòu)，表明納米Fe3O4能在反應(yīng)過(guò)程中很好地保持其磁性等特性，從而有利于其在后續(xù)的反應(yīng)過(guò)程中進(jìn)一步應(yīng)用，也證明了可以以納米Fe3O4粒子作為固定化脂肪氧合酶的載體進(jìn)行探索和研究。

2.3 熱失重分析

圖2 Fe3O4及固定化酶的XRD分析Figure 2 XRD patterns of bare Fe3O4and immobilized enzyme

圖3 固定化酶的熱失重分析Figure 3 TGA of immobilized enzyme

由圖3可知，熱失重曲線的形狀帶有過(guò)渡和傾斜區(qū)段；曲線的水平部分表示顆粒的質(zhì)量恒定沒(méi)有發(fā)生變化，而帶有斜率的部分表示顆粒的質(zhì)量發(fā)生了變化。溫度在0～200℃時(shí)，納米磁性載體和固定化酶的失重大約有1%和5%，這部分失重是因載體上的可揮發(fā)物和水分揮發(fā)等損失造成的，隨著溫度的繼續(xù)升高，脂肪氧合酶和其他包裹物都會(huì)被逐漸燒掉，當(dāng)溫度達(dá)到600℃左右時(shí)，曲線逐漸趨向水平，此時(shí)剩下的物質(zhì)為Fe3O4，而脂肪氧合酶等都已經(jīng)被全部燒掉，據(jù)此計(jì)算，載體上脂肪氧合酶的固定量約占固定化酶顆粒質(zhì)量的14%。

2.4 pH對(duì)酶活性能的影響

游離酶和固定化酶的活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4，固定化酶的最適pH為9.0，游離酶的最適pH為8.0。pH值對(duì)酶活的影響，主要是通過(guò)影響酶分子活部位上的有關(guān)基團(tuán)，從而進(jìn)一步影響與底物的結(jié)合與催化；固定化酶最適pH值向堿性一側(cè)發(fā)生偏移，主要原因可能是納米磁性微粒作為一種復(fù)合的堿性氧化物，對(duì)酸的耐受性較差，在堿性的環(huán)境下，固定化酶比游離酶有更寬的適應(yīng)范圍［16］，但隨著pH值的不斷升高，無(wú)論游離酶還是固定化酶均將逐漸失活。

圖4 pH對(duì)游離酶和固定化酶的活性影響Figure 4 Effect of pH on free and immobilized enzyme activity

2.5 溫度對(duì)酶活性能的影響

由圖5可知，溫度對(duì)酶促反應(yīng)速率的影響比較大，游離酶的最適溫度為30℃，而固定化酶的最適溫度為25℃，且在25～35℃內(nèi)都保持了較高的酶活力，說(shuō)明固定化酶擴(kuò)大了反應(yīng)溫度范圍，對(duì)溫度的敏感性有所下降；而對(duì)脂肪氧合酶的利用和處理都應(yīng)盡量在低溫下操作，以便保持較高的酶活［14］，所以將脂肪氧合酶的固定化有利于降低酶對(duì)溫度的苛刻要求。

2.6 雙氧水對(duì)酶活性能的影響

圖5 溫度對(duì)游離酶和固定化酶的活性影響Figure 5 Effect of temperature on free and immobilized enzyme activity

圖6 H2O2濃度對(duì)游離酶和固定化酶的活性影響Figure 6 Effect of H2O2concentration on free and immobilized enzyme activity

由圖6可知，游離酶和固定化酶的活性都隨著H2O2濃度的增加而增加，當(dāng)H2O2濃度為12.0g/L時(shí)，酶的活性達(dá)到最高，當(dāng)H2O2濃度繼續(xù)增加時(shí)，酶的活性開(kāi)始降低，可能是前期加入H2O2起到了誘發(fā)酶活性的作用，但環(huán)境中過(guò)多的H2O2會(huì)改變酶的結(jié)構(gòu)，從而抑制酶的活性［17］。最后在最適條件下經(jīng)測(cè)定，游離酶的酶活約為1.82×103U/mL，固定化的酶活約為2.31×103U/g。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用水熱法制備了納米磁性四氧化三鐵，然后用SiO2和KH550對(duì)其表面進(jìn)行表面修飾得到復(fù)合納米四氧化三鐵載體，再用戊二醛將脂肪氧合酶固定在復(fù)合載體上；通過(guò)電鏡觀察，合成得到的納米磁性四氧化三鐵呈亮黑色短棒狀粒子；通過(guò)XRD分析得到合成的顆粒具有四氧化三鐵的特征峰，且這些特征峰在經(jīng)過(guò)對(duì)顆粒的表面修飾和酶的固定化后仍然得到了保持；通過(guò)熱失重分析得到，載體上酶的含量占載體質(zhì)量的14%；通過(guò)對(duì)酶活的影響因素考察得到，游離酶的最適溫度為30℃，最適pH 8.0，H2O2濃度達(dá)到12.0g/L時(shí)，酶活達(dá)到最高，最適條件下酶活為1.82×103U/mL；固定化酶的最適溫度為25℃，最適pH 9.0，H2O2濃度為12.0g/L時(shí)，酶活最高，最佳條件下酶活為2.31×103U/g。結(jié)果表明以納米磁性四氧化三鐵固定脂肪氧合酶方法適宜可行，因而在此基礎(chǔ)上，可將以該材料固定化的脂肪氧合酶進(jìn)一步進(jìn)行應(yīng)用研究，如氧化氯丙嗪或發(fā)酵產(chǎn)生香味物質(zhì)等，同時(shí)也可以進(jìn)一步研究該酶的性質(zhì)，如酶的半衰期、穩(wěn)定性及使用次數(shù)等。

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