高密度固態(tài)培養(yǎng)產(chǎn)朊假絲酵母菌劑的工藝優(yōu)化

徐 速 孫立斌 楊海明 孫 慧 江連洲（.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 50030；.黑龍江省輕工科學(xué)研究院，黑龍江 哈爾濱 5000）

益生菌是指有益于宿主健康的微生物活菌制劑［1］。隨著抗生素濫用和殘留問題的出現(xiàn)，益生菌劑的研究受到學(xué)術(shù)界廣泛關(guān)注。已有眾多實例證明，益生菌能刺激宿主腸道內(nèi)生有益菌群平衡，抑制腸道中腐敗菌生長［2］，促進腸道中有害物質(zhì)的降解與轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)宿主免疫力，增加抗病能力［3，4］，從而提高動物的生產(chǎn)能力和增加養(yǎng)殖動物的經(jīng)濟效益。

產(chǎn)朊假絲酵母是被廣泛公認的畜禽動物益生菌，早在1989年就已被美國FDA（美國食品和藥品管理局）和AAFCC（美國飼料官方協(xié)會）批準為可直接飼喂動物的安全菌株，2008年中國農(nóng)業(yè)部也將其列入允許飼喂的菌種目錄［1］。酵母發(fā)酵飼料含有豐富的蛋白、小肽及氨基酸，增加飼料的營養(yǎng)價值［4］；產(chǎn)阮假絲酵母菌體所含蛋白質(zhì)和維生素B含量均較高，且生長所需營養(yǎng)物質(zhì)更簡單、可利用許多工農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物做原料生長繁殖［5，6］，菌體代謝后常常散發(fā)出宜人的香氣，可增加動物攝食欲望、提高生產(chǎn)能力。

中國每年加工大米、豆油、玉米后剩余大量副產(chǎn)物稻殼、豆粕、秸稈等，其中豆粕常用作替代玉米直接飼喂動物，原料利用率較低［6］；而秸稈、稻殼常常被農(nóng)民廢棄或焚燒，浪費資源污染環(huán)境。J.Y.Choi等［4］研究了液態(tài)發(fā)酵益生菌劑和固態(tài)發(fā)酵益生菌劑對斷奶仔豬的影響，發(fā)現(xiàn)在提高生產(chǎn)性能和腸道有益微生物菌群、降低腸道有害微生物菌群方面，固態(tài)發(fā)酵優(yōu)于液態(tài)發(fā)酵。固態(tài)發(fā)酵所制益生菌更利于益生菌的保存和活性的穩(wěn)定，實際應(yīng)用價值則更大。目前中國因生產(chǎn)麩皮的企業(yè)均在河南、河北、山東、山西等地，故在東北地區(qū)利用麩皮生產(chǎn)飼料酵母成本較高，而以秸稈稻殼替代麩皮固態(tài)發(fā)酵制備酵母菌還未見報道。本研究擬通過正交試驗、中心組合試驗設(shè)計及響應(yīng)面分析法優(yōu)化培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基成分，為豆粕秸稈稻殼混合制備酵母益生菌劑提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。同時，也對解決人畜爭糧矛盾、減少環(huán)境污染、改善農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

產(chǎn)阮假絲酵母2.118：黑龍江省應(yīng)用微生物研究所菌種保藏中心；

酵母種子培養(yǎng)基：PDA液體培養(yǎng)基，121℃滅菌20min；

酵母菌種子液：將已活化的酵母菌斜面菌體一菌環(huán)接入PDA液體種子培養(yǎng)基，30℃搖床180r/min培養(yǎng)16h；

1.2 材料

稻殼、豆粕：購自飼料市場，豆粕粉碎過40目備用；

秸稈：取自哈市農(nóng)戶自然干燥貯存，粉碎平均長度1～3 mm。

1.3 試劑與儀器

NaNO3、K2HPO4、KCl、MgSO4·7H2O、FeSO4：分析純，天津天力化學(xué)有限公司；

粉碎機：HR2168型，珠海飛利浦家庭電器有限公司；

恒溫水浴鍋：DK－98－1型，天津泰斯特儀器有限公司；

生化培養(yǎng)箱：LRH－250型，上海一恒科技有限公司；

特大容量恒溫振蕩器：TDHZ－2002B型，太倉市華美生化儀器廠；

超凈工作臺：ZHJH－1109型，深圳市朗普電子科技有限公司；

高壓滅菌鍋：XYRX－20型，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；

電熱干燥箱：DHG－9240A型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；

真空干燥箱：DZF6090型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.4 方法

1.4.1 微量元素溶液的制備

（1）1×微量元素溶液（m/V）：準確稱取分析純 NaNO30.6g、K2HPO40.2g、KCl 0.1g、MgSO4·7H2O 0.1g、Fe－SO40.002g，分別用少量蒸餾水溶解、合并后定容至100 mL，即得 NaNO30.6%、K2HPO40.2%、KCl 0.1%、MgSO4·7H2O 0.1%，F(xiàn)eSO40.002%的1×微量元素溶液，備用。

（2）2×微量元素溶液（m/V）：NaNO31.2%、K2HPO40.4%、KCl 0.2%、MgSO4·7H2O 0.2%，F(xiàn)eSO40.004%；3×微量元素溶液（m/V）：NaNO31.8%、K2HPO40.6%、KCl 0.3%、MgSO4·7H2O 0.3%，F(xiàn)eSO40.006%。制備方法同1.4.1（1）。

1.4.2 秸稈添加量對酵母菌生長的影響 固定每份原料總量40g，分別將豆粕∶稻殼∶秸稈按5∶2∶1，5∶2∶2，5∶2∶3，5∶2∶4，5∶2∶5比例混勻，再分別向每份原料添加50mL水及1×微量元素溶液，葡萄糖1g，在容器中混勻封口，121℃滅菌15min，冷卻，接種，鋪成2cm厚度，30℃培養(yǎng)24h，取樣，用血球計數(shù)器測定酵母菌數(shù)。每個樣品重復(fù)3次取平均值。

1.4.3 稻殼添加比例對菌體數(shù)目的影響 固定每份原料總量40g，分別將豆粕∶秸稈∶稻殼按5∶2∶1，5∶2∶2，5∶2∶3，5∶2∶4，5∶2∶5比例混勻，再分別向每份原料添加50mL水及1×微量元素溶液，1g葡萄糖，在容器中混勻封口，余下步驟同1.4.2。

1.4.4 碳源對酵母菌生長的影響 取原料豆粕、秸稈和稻殼按5∶2∶2混勻，每份40g，依次加入葡萄糖1，2，3，4，5 g，再分別向每份原料添加50mL水及1×微量元素溶液，混勻，余下步驟同1.4.2。

1.4.5 氮源對酵母菌生長的影響 取原料豆粕、秸稈和稻殼按5∶2∶2混勻，每份40g，向每份原料中依次加入硫酸銨0.2，0.4，0.6，0.8，1.0g，或 尿 素 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0g；再分別向每份原料加入50mL水及1×微量元素溶液，1g葡萄糖，余下步驟同1.4.2。

1.4.6 固態(tài)培養(yǎng)產(chǎn)朊假絲酵母活菌劑的生長曲線 取原料豆粕、秸稈和稻殼按5∶2∶2混勻，每份40g，分別向每份原料加入50mL水及1×微量元素，在容器中混勻封口，121℃滅菌15min，接種，鋪成2cm厚度，30℃培養(yǎng)12h后每隔2 h取樣，用血球計數(shù)器測定酵母菌數(shù)。每個樣品重復(fù)3次取平均值。

1.4.7 正交試驗確定最佳培養(yǎng)基成分 在碳源、氮源單因素試驗基礎(chǔ)上，對培養(yǎng)基成分中影響酵母菌生長數(shù)量的因素葡萄糖、硫酸銨、微量元素營養(yǎng)液添加倍數(shù)進行三因素三水平正交試驗，以確定最佳培養(yǎng)基成分配比。

1.4.8 中心組合試驗設(shè)計優(yōu)化酵母菌固體培養(yǎng)條件 利用Design－Expert 7.0軟件，采用中心組合設(shè)計試驗方案建立關(guān)于接種量、固體培養(yǎng)基厚度、水分添加量和培養(yǎng)溫度四因素變量的二次回歸模型，以確定最佳培養(yǎng)條件，試驗設(shè)計因素水平見表1。選取接種量、厚度、水分添加量和發(fā)酵溫度4個因素為自變量，以酵母菌的菌數(shù)為響應(yīng)值，以前期單因素試驗最佳結(jié)果為中心點，根據(jù)中心組合設(shè)計原理設(shè)計試驗。取5種水平自變量編碼，中心點試驗重復(fù)試驗數(shù)為6，試驗重復(fù)3次取平均值，每組試驗原料用量40g。

表1 中心組合試驗設(shè)計因素水平編碼表Table 1 Levels of independent variables of simplex－centroid design

1.4.9 酵母菌劑的干制 將最佳培養(yǎng)的酵母菌劑40℃真空干燥8h或常壓45℃干燥24h后，平板計數(shù)測定酵母菌活菌數(shù)。重復(fù)3次取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 秸稈添加比例對酵母菌生長的影響

在實際操作中，豆粕滅菌后黏度增大，容易結(jié)塊，不利于氧氣的傳質(zhì)。秸稈主要含纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等不易被酵母菌利用的成分，基質(zhì)中添加適當比例的秸稈既起到機械支撐作用，又可增加培養(yǎng)基通透性和通氣量，利于氧氣的流通和酵母的增殖。由圖1可知，雖然隨著原料中秸稈比例的增加，酵母菌活菌數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢，但當秸稈比例從1/8增加到4/11時，酵母菌對數(shù)值從8.4降到8.1，活菌數(shù)從2.6×108g－1降低到1.4×108g－1，仍保持在同一數(shù)量級，說明秸稈比例增加對酵母活菌數(shù)下降并不成正比，其影響趨勢較平緩。結(jié)合原料成本與活菌數(shù)量綜合考慮，選擇豆粕∶稻殼∶秸稈＝5∶2∶2較適宜。

圖1 秸稈添加量對酵母菌生長的影響Figure 1 Effects of corn straw on the growth of yeast

2.2 稻殼添加比例對菌種的影響

據(jù)資料［7］報道，稻殼含有大量纖維素、木質(zhì)素、二氧化硅及少量的蛋白質(zhì)和鈣磷元素，如不經(jīng)處理，應(yīng)用于飼料將影響動物的消化吸收率。雖然稻殼可利用的營養(yǎng)成分較貧乏，但試驗中發(fā)現(xiàn)稻殼具有良好的多孔性和吸水性，可作為固態(tài)發(fā)酵營養(yǎng)物質(zhì)良好的載體，為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基提供良好的通氣性和保濕性。同時試驗中還觀察到，培養(yǎng)結(jié)束時培養(yǎng)基表觀濕度增大，分析可能是通過酵母菌的生長代謝產(chǎn)生了水分，增加了濕度所致。推測這將軟化稻殼中纖維素等成分，釋放更多的可溶性物質(zhì)，增加培養(yǎng)基中菌體數(shù)目，從而增加菌體蛋白含量。由圖2可知，隨著稻殼添加量的增大，酵母菌的生長數(shù)量呈現(xiàn)先增加、后降低、然后趨于平穩(wěn)的走勢，即添加比例（豆粕∶秸稈∶稻殼）從5∶2∶1至5∶2∶2時，酵母菌對數(shù)從8.37增加到8.47，酵母菌數(shù)量從2.3×108g－1增加至3×108g－1；當增至5∶2∶3以上時，酵母菌對數(shù)在8.25～8.33，酵母數(shù)保持在1.8×108～2.15×108g－1。綜合考慮，選擇豆粕∶稻殼∶秸稈＝5∶2∶2較為適宜。

2.3 碳源對酵母菌生長的影響

葡萄糖是酵母菌可以直接利用的碳源，在酵母生長代謝中既作為酵母菌細胞骨架，又作為代謝的能源物質(zhì)。隨著市場上淀粉糖生產(chǎn)技術(shù)的提高，葡萄糖價格不斷下降，可作為酵母菌生長的輔助碳源。由圖3可知，在原料比例一定的條件下，起初酵母菌的數(shù)量隨著葡萄糖量的增加而增加，當葡萄糖增加到4g時，酵母菌生長數(shù)量達到最高，葡萄糖的添加量繼續(xù)增高時，酵母菌數(shù)量開始下降。推測可能是隨著葡萄糖添加量增加，酵母菌生長外環(huán)境碳源濃度的增大，導(dǎo)致酵母生長的外環(huán)境產(chǎn)生更高的滲透壓，影響酵母菌細胞代謝的進行，致使酵母菌生長速率減緩，數(shù)量下降。因此，選擇添加葡萄糖4g。

圖2 稻殼添加量對酵母菌生長的影響Figure 2 Effects of rice hull on the growth of yeast

圖3 葡萄糖對酵母菌生長的影響Figure 3 Effects of glucose on the growth of yeast

2.4 氮源對酵母菌生長的影響

尿素、硫酸銨、蛋白胨是常用的氮源，因蛋白胨的價格較高，而本試驗的目的是通過最小的花費獲得最大的酵母菌數(shù)量，所以選用尿素和硫酸銨做外加的氮源。由圖4可知，添加硫酸銨的效果為先揚后平，最佳添加量為0.4g，酵母菌最大數(shù)量4.25×108g－1。而添加尿素的效果為先揚后抑，最佳添加量為0.8g，酵母菌最大數(shù)量4.0×108g－1。目前市場上尿素的價格遠高于硫酸銨價格，且尿素添加量大于硫酸銨用量，不論是從經(jīng)濟角度還是實際效果來看，選擇硫酸銨添加量0.4g更適宜。

2.5 固態(tài)培養(yǎng)酵母菌劑的生長曲線

圖4 氮源對酵母菌生長的影響Figure 4 Effects of inorganic nitrogen on the growth of yeast

圖5 酵母菌固態(tài)培養(yǎng)生長曲線Figure 5 The growth curve of yeast through solid－state ferment

由圖5可知，當取發(fā)酵12h樣品檢測時，酵母菌開始進入對數(shù)生長期。當發(fā)酵時間大于28h以后，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分逐漸消耗，酵母菌的生長達到平穩(wěn)期。為了生產(chǎn)更多的酵母菌，選擇26～28h終止發(fā)酵為宜。

2.6 正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基成分結(jié)果分析

在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過碳源、氮源和微量元素三因素正交試驗進一步優(yōu)化培養(yǎng)基成分比例，正交試驗因素水平取值見表2，結(jié)果見表3。通過極差分析可知，對酵母菌生長影響因素從大到小依次為葡萄糖＞微量元素＞硫酸銨。

為了檢驗直觀分析中各因素不同水平差異是否顯著，進一步采用SPSS17.0對上述影響因素進行單因素方差分析即Tukey HSD多重比較，結(jié)果顯示葡萄糖水平1與水平3差異不顯著，但二者均與水平2差異極顯著，硫酸銨和微量元素各水平倆倆之間差異均不顯著，故選擇葡萄糖添加量4g、硫酸銨0.2g和微量元素1倍濃度，即A2B1CI為宜。將理論獲得的A2B1CI組合重復(fù)3次實驗，酵母菌數(shù)平均值（8.10±0.07）×108g－1，驗證了所得組合穩(wěn)定可靠。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Levels of different variables of orthogonal experiments

表3 正交試驗結(jié)果與分析Table 3 The results and analyses of orthogonal experiment

2.7 中心組合試驗設(shè)計優(yōu)化酵母菌培養(yǎng)條件

2.7.1 中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果分析 按照1.4.8進行中心組合試驗優(yōu)化酵母培養(yǎng)條件，結(jié)果見表4。

通過Design－expert 7.0對試驗數(shù)據(jù)進行回歸數(shù)據(jù)分析，建立二次回歸模型：

對模型數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果見表5。

由表5可知，回歸模型的F值55.85，“Prob＞F值”＜0.000 1，說明自變量與響應(yīng)值的回歸關(guān)系顯著；失擬項的F值為2.24、“Prob＞F值”0.193 4，說明失擬項與純誤差差異不顯著。該模型的決定系數(shù)R2為0.981 2，調(diào)整后的決定系數(shù)為0.963 6，變異系數(shù)5.29%。決定系數(shù)介于0至1之間，決定系數(shù)越大，說明擬合方程的參考價值越大，模型擬合度越好；變異系數(shù)越小表示試驗可信度越高［8］。綜上可知，所建模型擬合度良好，可以理論推測因自變量變化而對響應(yīng)值的影響。

由表5中F值可知，自變量因子貢獻率為D＞A＞B＞C，即培養(yǎng)溫度＞接種量＞厚度＞水分添加量，即培養(yǎng)溫度對菌種生長的影響最為顯著，接種量與厚度次之，水分添加量相對影響較小。模型中自變量之間的交互作用對響應(yīng)值影響明顯的有AB（接種量與厚度）、AC（接種量與水分）、BC（厚度與水分）、CD（水分與溫度），其3D響應(yīng)面交互作用見圖6～9。圖6～9中的酵母菌數(shù)量均隨著接種量、厚度、水分、發(fā)酵溫度呈現(xiàn)不同程度的先增加后降低趨勢。固態(tài)培養(yǎng)中酵母菌數(shù)的增長除了與營養(yǎng)成分相關(guān)外，還受氧氣、水分、溫度、初始菌種數(shù)量影響。酵母菌是好氧微生物，增殖需要足夠的氧氣，培養(yǎng)基厚度過大將影響氧的供應(yīng)。酵母生長代謝需要一定的水分活度，水分含量越高，水分活度越大，酵母菌越易生長，但過多的水分會粘結(jié)固態(tài)培養(yǎng)基原料，導(dǎo)致氧氣傳質(zhì)受阻，影響酵母菌生長繁殖。酵母菌生長有其最適溫度，在最適溫度前，隨著溫度升高，酵母菌生長加快，但當超過最適溫度時，則影響到酵母菌自身代謝而呈下降趨勢。從圖6～9可以看出，圖中兩兩因素均存在交互作用，但A（接種量）與C（水分）圖形最陡，交互作用最明顯。

表4 中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Simplex－centroid design and response values

表5 中心組合試驗方差分析表Table 5 ANOVA for the reduced quadratic mixture models

圖6 接種量A與厚度B交互作用響應(yīng)面三維圖示Figure 6 Combined effects of inoculum size A and thickness B on yeast count

通過Design－Expert 7.0軟件優(yōu)化功能，得到模型的最優(yōu)工藝參數(shù)和預(yù)測值：接種量3.51%，厚度1.29cm，水分36.53mL，溫度30.58℃，酵母菌數(shù)理論預(yù)測值1.227×109g－1。結(jié)合實際情況，最終優(yōu)化參數(shù)為接種量3.50%，厚度1.3cm，水分添加量∶原料＝1∶1（m∶m），溫度30.6℃。

2.7.2 驗證實驗 在最佳培養(yǎng)條件下，重復(fù)5次固體培養(yǎng)，平板涂布計數(shù)酵母菌數(shù)量分別為1.23×109，1.35×109，1.10×109，1.40×109，1.25×109CFU/g，平均值為（1.27±0.12）×109CFU/g，與模型預(yù)測值1.23×109CFU/g接近，說明模型擬合性較好，可以用來理論預(yù)測培養(yǎng)的酵母活菌數(shù)值，該模型真實有效。

圖7 接種量A與水分添加量C交互作用響應(yīng)面三維圖示Figure 7 Combined effects of inoculum size A and water addition C on yeast count

圖8 厚度B與水分添加量C交互作用響應(yīng)面三維圖示Figure 8 Combined effects of thickness B and water addition C on yeast count

圖9 水分添加量C與溫度D交互作用響應(yīng)面三維圖示Figure 9 Combined effects of water addition C and temperature D on yeast count

2.8 酵母菌劑的干制

按最佳方法固態(tài)培養(yǎng)28h酵母菌數(shù)折合絕干料均值（2.92±0.05）×109CFU/g。經(jīng)真空40 ℃干燥8h后測得酵母菌活菌數(shù)折合絕干料（2.34±0.03）×109CFU/g，存活率80%。常壓45℃干燥24h后測得酵母菌活菌數(shù)折合絕干料（1.90±0.03）×109CFU/g，存活率65%。

3 結(jié)論

本試驗開展了以秸稈稻殼替代麩皮固態(tài)培養(yǎng)產(chǎn)朊假絲酵母的研究，利用產(chǎn)朊假絲酵母生長條件相對簡單的特點［9］，采用中心組合試驗設(shè)計及響應(yīng)面分析法優(yōu)化了酵母菌培養(yǎng)條件，發(fā)酵28h，酵母活菌計數(shù)（2.92±0.05）×109CFU/g絕干，試驗結(jié)果表明以秸稈稻殼替代麩皮固態(tài)培養(yǎng)產(chǎn)朊假絲酵母效果良好。

目前，以豆粕、麩皮為原料，利用酵母菌或復(fù)合菌種固態(tài)發(fā)酵提高原料蛋白含量的研究居多，而利用豆粕為主要原料制備活性酵母菌劑的報道較少。楊世平等［10］利用豆粕、麩皮、紅糖、酵母膏等培養(yǎng)沼澤生紅冬孢酵母，雖然所獲酵母活菌數(shù)較高，但成本偏高，發(fā)酵時間偏長。相比之下，本試驗更注重低成本和短時間，且原料更切合北方實際，具有潛在的應(yīng)用價值。本試驗常壓干制，適合中小企業(yè)的應(yīng)用；真空干燥，更適宜投資大的企業(yè)應(yīng)用。

Mitchell等［11］認為固態(tài)發(fā)酵中存在傳熱傳質(zhì)的問題，為此，在小試基礎(chǔ)上擴大生產(chǎn)應(yīng)進一步摸索參數(shù)，可通過改善通風(fēng)等因素，進一步提高供氧能力，以提升酵母活菌數(shù)量，攤薄生產(chǎn)成本，制備高效廉價的酵母益生菌劑。

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